从分离纯化方法出发，完善自己的细胞外囊泡研究（内含赠书福利）

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几乎所有的细胞都可以释放细胞外囊泡，因此在生物体来源的几乎所有类型的体液中都有细胞外囊泡的存在。近些年，随着研究技术的不断完善，细胞外囊泡的研究逐渐成为一个新兴的热门领域。

细胞外囊泡在生理病理状态下的功能、生物源性纳米药物载体以及诊断标志物开发是目前细胞外囊泡研究的主要方向。细胞外囊泡根据直径和其来原位置的差别通常被分为外泌体、微囊泡和凋亡小体等。由于目前细胞外囊泡的分离纯化策略还无法精确的分离特定的组分，现在更多的研究将200nm以下的细胞外囊泡称之为小细胞外囊泡（sEV），sEV是目前细胞外囊泡研究中大家重点关注的研究对象。

细胞外囊泡的分离纯化是对其表征和进一步研究的前体。近些年，细胞外囊泡的分离策略多种多样，但最广为接受的依旧是基于超速离心的富集纯化策略。基于超速离心，目前主要存在两种分离方式，其一是差速离心，即通过2000g 10分钟去除死细胞，1万g 30分钟去除细胞碎片，最后在10万-12万g条件下，超速离心70-120分钟；其二是密度梯度离心，即在差速离心之后，再通过蔗糖或碘克沙醇构建密度梯度，对样品进行离心处理，取密度1.13-1.19 g/ml的区域，最后稀释并通过超速离心获得sEV沉淀。虽然目前差速离心是研究报道中最常见的分离策略，但是在越来越多的高质量研究报道中密度梯度离心逐渐成为了标配（详见：【套路】耀眼的文章都用什么方法分离外泌体）。

为什么越来越多的高质量研究开始将密度梯度离心作为sEV纯化的标配？这需要从以下三个方面来解释。

1、密度梯度离心获得的样品，每微克蛋白对应的囊泡更多

对比常规超速离心和密度梯度离心分离的细胞外囊泡样品。使用相同量的蛋白上样分析，密度梯度离心获得的样品中细胞外囊泡标志蛋白的数量更多，说明单位蛋白对应的细胞外囊泡更多。

2、密度梯度离心获得的样品，游离杂蛋白更少

早期研究认为，GAPDH是存在于sEV中的蛋白。早期一些高质量研究报道都会将GAPDH作为sEV的内参。但是通过密度梯度离心分离纯化细胞外囊泡，检测GAPDH会发现其并不存在于sEV的密度层，这说明常规超速离心分离细胞外囊泡，GAPDH会作为游离的杂蛋白混入细胞外囊泡样品中。由此可见，密度梯度离心能够很好的规避杂蛋白对实验结论的影响。

3、密度梯度离心获得的样品，对生物学功能的调控作用更明显

以细胞外囊泡对神经元的营养作用为例。相比于常规超速离心获得的细胞外囊泡样品，密度梯度离心获得的囊泡样品对神经元的营养作用更强，表型更为明显。这可能是由于密度梯度离心获得的样品，一方面细胞外囊泡的浓度更大，另一方面杂蛋白更少。这对于我们研究细胞外囊泡对生物学过程的调控作用具有很大的优势。

综合上述分析，相比于传统的差速超速离心，密度梯度超速离心分离的细胞外囊泡样品无论在细胞外囊泡的浓度、纯度还是生物学功能方面都具有更为出色的表现。这也是越来越多的高质量研究报道开始将密度梯度离心作为细胞外囊泡标准分离策略的原因。因此，当大家需要更纯更好的细胞外囊泡样品时，密度梯度离心是一个不错的选择。

参考文献：

1. Reassessmentof Exosome Composition. Cell
2. characterisationof leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison betweendifferential ultracentrifugation and Optiprep™ density gradient isolation,Journal of Extracellular Vesicles
3. Comparisonof ultracentrifugation and density gradient separation methods for isolatingTca8113 human tongue cancer cell line‑derived exosomes. Oncology Letters