元气满满的外泌体
小编有话说
其实外泌体最开始被发现的时候，被认为是细胞排出的代谢废物。作为当时的“小渣渣”，甚至说“小废柴”，它也丝毫不放弃，终于到达了有“大作为”的一天。所以说，科研无止境，且行且探索！说不定现在仍是科研小透明的你，未来也有受人瞩目的一天哟~加油，everyone！
引言
人体作为一个整体，不同器官、组织和细胞之间时刻进行着密切通讯，也正是这种通讯达到了1+1>2的效果，使人体区别于单个器官的总和，甚至产生了一门专门的学科“系统生物学”来研究这种通讯。体液（激素）调节、免疫反应和细胞通讯等细胞间信息交流的方式已经广为人所知，而在近几年，一种新兴的细胞间交流方式得到了科学家的广泛关注，它通过一种由细胞分泌的囊泡来进行，这囊泡被命名为细胞外囊泡（EVs）。
EVs携带的生物活性分子，能够参与代谢微环境中代谢组织和细胞之间的通讯，影响机体的代谢平衡以及代谢疾病的发展进程。此外，EVs能够被体内大多数细胞分泌，通过体液运输到达受体细胞后发挥功能，因其具有稳定、可捕获、有生物活性、实时检测等特征，它在疾病诊疗方面的应用潜能也越来越受到人们重视。
Evs主要分为两种：核外颗粒体（ectosomes），直接通过细胞膜出芽形成囊泡；而外泌体（exosomes）则通过胞内体内陷形成多泡体再与质膜融合释放[1]。本篇我们将着重介绍细胞外囊泡的当红小旦—外泌体。
接下来，就跟着小编，以外泌体第一视角，接受更多关于外泌体的干货暴击吧~
Part1 外泌体的自我介绍
在下乃大名鼎鼎 光环加身 冉冉升起的医疗新星 无数学者的心上宝—外泌体是也
话不多说，先甩份简历，自己体会：
（简历来自Kalluri R et al, 2020, Science.）
（图片来自Shao H et al, 2018, Chem Rev.）
正如简历上background所介绍的，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）,这是内体经过内质网和高尔基体加工后的形式，里面含有很多由内体向内凹陷而形成的小囊泡，因此被称为多囊泡体。多囊泡体里的小囊泡就是我的前身啦，当MVBs外膜与细胞膜融合时，这些小囊泡（或者称之为外泌体）就可以释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体；在生物体内，外泌体天然存在于各种体液中，比如血液、尿液、脑脊液、淋巴液和乳汁等[1]。
在体内我扮演者“快递员”的角色，维系细胞间的物质（脂质，蛋白质，核酸等）交流。自然而然，在很多生理病理上，我起着重要的作用，如肿瘤的生长与迁移、免疫反应和感染、代谢和心血管疾病等[2，3]。另外，谦（高）虚（调）的说，科学家们近几年又挖掘出我的潜藏技能-临床应用：比如外泌体作为疾病诊断的生物标志物，外泌体靶向给药系统，以及外泌体临床治疗等 [1]。
Part2 外泌体的研究火爆
什么？听说有人说我是被细胞抛弃的废料？
对于腐旧观点，我向来都是摆事实，列证据。
证据第一波：感受一下我在pubmed上的“流量”冲击。近年来，我在各领域的研究可谓是如火如荼，时至今日，外泌体相关领域发表的文章高达13722篇，接近5年前研究总数的4倍。而且研究攀升速度明显，相信随着时间的推移，大家会更加深入的认识我。
证据第二波：看看我在国自然上的推崇程度。自2015年精准医疗提出后，国自然上我的形式一片大好。付出总有回报，目前，我作为细胞与细胞间通讯中起关键组分，已经越来越被大家认同。
国自然最新热点外泌体，你get到了么？中标数高达519个，各种相关paper也是层出不穷，炙手可热的程度可见一斑。在机体内，我广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动；同时，我还身兼数职，具有抗原递呈、免疫逃逸等免疫调节作用和诱导正常细胞转化，促进肿瘤发生及转移的作用；此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送，装载的药物类型包括小分子化学药物、蛋白质和肽、核酸药物等。所以说，国自然入股外泌体，丝毫不亏啊。
Part3 外泌体的发家史
外泌体诞生记
你想了解我是怎么来的？客官别急，容我慢慢叙来~
（图片来自Barile L et al, 2017, Pharmacol Ther.）
我是通过细胞膜的两次凹陷所形成的。
为响应细胞环境和信号等的号召，细胞膜的第一次凹陷形成了早期内涵体（Early-sorting endosome，ESEs），这些ESEs可以与其他细胞器发生物质交换或者互相融合，同时发布招募令，核酸，蛋白质等内容物纷纷合成并移动至早期内涵体。接着，内体与细胞溶质成分相互作用，微囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）由ESEs向内出芽形成，ESEs到这里就成功进化成晚期内涵体啦（Late-sorting endosomes，LSEs），LSEs别名细胞内多囊泡体（intracellular multivesicular bodies，MVBs）。细胞形成MVBs后可能会通过与自噬体或溶酶体融合而被降解，也可能通过与质膜融合，释放其中的物质，包括ILVs，这些ILVs就是我的前体啦[1]。
在胞内”发家”时，在内陷小泡的引荐下我有幸遇到了几个乐于助人的朋友，比如ESCRT（endosomal sorting complex required for tran）团体，他们包含四种蛋白复合体：ESCRT0依赖泛素聚集要装载的货物；ESCRT1/2出芽；ESCRT3剪断囊泡。在他们的热心帮助下，ESEs才能顺利形成ILVs。还有在Rab-GTP酶（Rab25）活化作用下，我才能与质膜顺利碰面，并在Rab27b的帮助下毫发无损的带着快件通过细胞膜的第二次凹陷，通过SNARE依赖或非依赖途径愉快被释放到细胞外
此外，还有Sytenin-1，TSG101，ALIX，syndecan-1等等[4]。朋友甚多，满心感激，在此就不一一致谢啦。
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哆啦A梦的口袋
作为一名合格的快递员，我自诞生后，就克己守礼，兢兢业业，裹着自己的“快件”直奔赴靶细胞。前文也简单提到了一下，我揽收的“快件”有哪些呢？蛋白质~核酸~脂类 [5]~
这样划分太大范围啦！作为一个细心贴心暖心的宝宝，我给你列了一个清单。
注：不全包括（不是每个exosomes都包裹以下货物）且不限于（空间有限，内容太多，不方便一一展示）以下条目哟
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芝麻开门
常言道，浓缩的都是精华！我呢，也确实人小本事大，而这还真不是我吹牛。我有几个神技能：
1. 飞毛腿：外泌体在细胞外空间释放后，可在血液和其他体液中扩散，被邻近组织甚至远端组织吸收。
2. 保护盾：外泌体可以防止降解，并被不同的器官迅速吸收，如肝脏、肺和脾脏等。经静脉注射标记外泌体的小鼠循环外泌体的半衰期已被评估为2分钟左右，但在注射后数小时的循环体液中仍可检测到一些外泌体 [8，9]。
3. 特别擅长打交道：那么我都是怎么与靶细胞交流的呢？走亲访友第一步，当然是迈入人家的门槛啦！
（图片来自Huang-Doran I et al, 2017, Trends Endocrinol Metab.）
在到达受体细胞后，我主要以四种方式被吸收[6]。
① 钥匙开锁：外泌体膜蛋白与靶细胞质膜受体相互作用，刺激细胞内信号级联。比如炎性因子刺激的神经干细胞释放携带IFNγ及其受体的外泌体，在受体细胞中特异性激活STAT1通路[10]。
② 融为一体：外泌体膜与靶细胞膜融合，将外泌体货物直接输送到细胞质中。比如黑色素瘤细胞通过促进细胞质膜与外泌体的融合实现对外泌体组分的吸收[11]。
③ 门洞大开：靶细胞的吞噬作用和大胞饮作用。典型的发现是KRas突变的胰腺癌细胞可促进大胞饮作用促进外泌体的吸收[12]。
④ 打卡入门：网格蛋白介导的内吞作用。而神经分泌的PC12细胞在主要通过网格蛋白有被小泡吸收适当大小的外泌体[13]。
但是具体通过哪种方式进入受体细胞影是由许多因素来调控，还有很多机制等待被发现～等着大家慢慢来探索啦！
Part4 外泌体的实验第一步
由于我在各大领域备受欢迎，大家对如何完全破解我，也更加感兴趣了。想要破解我，基础研究前两步：外泌体的提取以及鉴定。说说简单，迷你如我，可不好找哦，各种方法也各有优劣。在此大方的分享给大家。
外泌体的提取方式[14]
Tips: 超速离心法是最常用的外泌体纯化方法
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外泌体的鉴定
微小如我，你怎么知道找到的我是我？
绕口令般的问题，答案请拿好。
外泌体身份确认三连——电镜，粒径分布，蛋白标志物鉴定[15,16]。
国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议，对于提取获得的外泌体，需要通过以下手段进行确认：通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征、通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）、通过Western Blot (WB) 来检测样品中细胞外囊泡的标志蛋白。这三种方式是相辅相成的，是因为目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样本，因此以上任何单一的鉴定方法都无法确定外泌体的存在。
电镜形态学鉴定：透射电子显微镜 (Transmission electron microscope, TEM)分辨率可达0.1~0.2 nm，可将被观察物体放大至数百万倍，非常适合进行外泌体亚显微结构的观察。透射电镜下典型的外泌体的结构为茶托型或一侧凹陷的半球形，并且具有双层囊膜结构。而当电镜图观测到的样品结构不是典型外泌体样结构时，还需要增加免疫胶体金电镜进行验证。
NTA粒径分布：通过NTA粒径分析可以检测样本中所有外泌体颗粒的粒径分布情况及整体浓度。表观生物采用纳米颗粒追踪分析 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)技术可以快速、精准地通过粒子直径分析系统测算和统计样品中粒子的直径分布，分析外泌体粒径分布浓度，为外泌体存在提供有力证据 。
WB蛋白标志物鉴定：通过Western Blot检测样品中是否有外泌体相关marker蛋白的富集。那外泌体的marker蛋白有哪些呢？较为常用的有：CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101和Calnexin（其中Calnexin是细胞内质网的标记物，在细胞提取液中检测到，在EVs中未检测到，说明了分离的EVs并未受到细胞碎片的污染。常用作阴性对照）。
Part5 外泌体研究的拦路虎
没有哪项研究是一帆风顺，一番坦途，一蹴而就的，对我的研究技术自然也有很大的进步空间。特在此自（立）曝（下）家（誓）丑（言）。随着新技术的采用，我保证将不断自我完善。
外泌体研究的局限性主要体现在以下几个方面：
1. 目前，外泌体生物学研究在很大程度上是通过细胞培养系统来阐明的。因此，需要更多的使用小鼠模型和生理相关的实验条件来进行实验。外泌体可诱导细胞内的分子改变，但问题是，目前使用的是从细胞培养中获得的外泌体。外源性大剂量的外泌体注入小鼠体内是否与体外细胞表型相关，包括癌症进展的调控、肿瘤的诱导和组织的再生等 [18]的结果在体内是否具有相关性等，还需要更精确的分离和鉴定程序[17]。
2. 随着对细胞外囊泡的异质性、载货量和功能的了解不断发展，对外泌体的精确描述的需求也不断增长。目前尚不清楚未经处理的外泌体的生理水平是否在体内发挥调节稳态或病理功能(或两者都没有)。此外，该领域迫切需要动物模型来研究外泌体的生物学发生、转运和吸收等。在这些方面，果蝇、秀丽隐杆线虫、非洲爪蟾和斑马鱼模型可能会提供额外的见解[18]。
3. 外泌体是由细胞产生的，外泌体是否能生长和分裂，以及在适当的环境下参与信号事件和自主生化反应，仍有待确定。此外，外泌体和逆转录病毒之间的相似性也提出了外泌体可能作为先于单细胞生物体的原始粒子发挥作用的可能性[19，20]。
参考文献
1. LeBleu R et al. Science. 2020 Feb 7;367(6478).
2. MathieuM et al. Nat Cell Biol. 2019 Jan;21(1):9-17.
3. Pegtel DM et al. Annu Rev Biochem. 2019
4. Barile L et al. Pharmacol Ther. 2017
5. Shao H et al. Chem Rev. 2018;118(4):1917-1950
6. Huang-Doran I et al. Trends Endocrinol Metab. 2017;28(1):3-18
7. Steinbichler et al. Seminars in Cancer Biologyr. 2017; 170-181.
8. Takahashi Y et al. J Biotechnol. 2013;165:77-84.
9. Saunderson SC et al. Blood. 2014;123:208-216.
10. I. Parolini et al. J. Biol. Chem. 2009; 284; 34211–34222
11. Tian et al. J. Biol. Chem. 2014; 289; 22258–22267
12. S. Kamerkar et al. Nature. 2017: 546;498–503
13. C. Cossetti et al. Mol. Cell. 2014; 56:193–204
14. Li P et al. Theranostics. 2017; 7(3): 789-804.
15. Zhu J et al. Theranostics. 2019.
16. Choi JS et al. J Extracell Vesicles. 2019.
17. Thery C et al. Journal of extracellular vesicles, 2018, 7(1): 1535750-1535783.
18. J. Skog et al. Nat. Cell Biol. 2008; 10; 1470–1476
19. G. F. Joyce et al. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10, a034801
20. E. Noltet Hoen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2016; 113: 9155–9161
代谢学人 The metabolist