非肿瘤生信：冠心病的CXCL5单基因分析

Clinical Evidence Supports a Protective Role for CXCL5 in Coronary Artery Disease
临床证据支撑CXCL5在冠状动脉疾病中的保护作用

一.研究背景

在65岁或以上的患者中，心肌梗死后的5年死亡率为46%至58%。然而，在临床试验中，老年患者的代表性往往不足，而且在这一人群中，作为动脉粥样硬化性冠状动脉疾病(CAD)发展和进展基础的病理生理学尚未得到严格评价。作者在美国东南部的一个临床队列中研究了趋化因子CXCL5和CAD之间的关系，并使用系统生物学方法来了解CXCL5调节的遗传影响和与CAD相关的分子表型。

二.分析流程

本文运用到的关键方法为eQTL分析：探讨了CXCL5水平与CAD严重程度的关系，从而鉴定了数量性状表达位点rs394408可能是CAD治疗的潜在靶点。

  • 首先QTL是数量性状位点，比如体重是一个数量性状，其对应的控制基因的位点就是一个数量性状位点，而eQTL就是控制数量性状表达位点。

  • 表达数量性状基因座（expression Quantitative Trait Loci,eQTL）是对上述概念的进一步深化，它指的是染色体上一些能特定调控mRNA和蛋白质表达水平的区域，其mRNA/蛋白质的表达水平量与数量性状成比例关系。

  • eQTL可分为顺式作用eQTL和反式作用eQTL，顺式作用eQTL就是某个基因的eQTL定位到该基因所在的基因组区域，表明可能是该基因本身的差别引起的mRNA水平变化；反式作用eQTL是指某个基因的eQTL定位到其他基因组区域，表明其他基因的差别控制该基因mRNA水平的差异

三.结果解读

1.队列人群

表1展示了此次队列143名阻塞性CAD患者的临床信息。

表1.CAD状态的人群特征研究

2.保护性趋化因子CXCL5与CAD严重程度呈负相关

图1.血浆CXCL5水平与冠心病(CAD)严重程度呈负相关

图1：作者测量了血浆中CXCL5的水平，并使用logistcs回归来测量CAD严重程度与CXCL5水平之间的关系。

  • 图1A：结果显示，CXCL5的高水平时，CAD的分级较低。

  • 图1B：性别无统计学意义(P = 0.044和P = 0.018，分别为女性和男性)。

表2. CXCL5水平和CAD Score的回归分析

表2：作者对 CXCL5水平和CAD Score作了回归分析。将性别、他汀类药物使用、高血压、高脂血症、肥胖、吸烟状况和糖尿病等因素并入了该回归模型中

图2：血浆CXCL5水平与脂质、他汀类药物使用的关系

图2A：用回归曲线对所示变量进行两两相关性分析。

  • CXCL5与任何脂质分子均无相关性，但它与血小板计数之间存在弱正相关性。

图2B：依据性别和是否为阻塞性CAD，评估CXCL5水平情况。

  • 只有“使用他汀类药物、为阻塞性CAD患者”这一组的CXCL5呈现低水平(P = 0.0098)。

图3C-D：作者使用方差分析检查了队列中五种他汀类药物与CXCL5水平的关系，来确定他汀类药物种类和强度的差异是否与CXCL5水平相关。结果均无统计学意义。

图3.血浆CXCL5水平与CAD、先前罹患的心肌梗死(MI)的关系

图3：依据MI病史和阻塞性CAD的有无，使用方差分析来比较CXCL5水平。

  • 结果显示CAD患者呈现CXCL5低水平；而患MI与否无统计学意义。

3.hsCRP炎症生物标志物与冠心病的严重程度相关

表3.血浆炎症标志物水平与CAD score的回归分析

表3：作者同样作了回归分析来评估各种炎症标志物与CAD score的关系。

  • 只有hsCRP具有较显著的统计学意义（hsCRP在Ordinal中：P=0.021；在Nominal中：P = 0.083）。

4.与CXCL5表达相关的基因多态性

图4：基因与CXCL5表达和循环CXCL5水平的关系

图4A：作者在队列中发现了CXCL5表达的eQTL：rs394408。

图4B：作者分析了来自GTEx的338个独立样本的全血中相同的eQTL，来验证rs394408次等位基因与CXCL5表达的关系。

图4C：作者研究了含有rs394408位点的单核细胞中的eQTL，然后发现CXCL5的cis-eQTLs位于4号染色体上的一个区域，该区域上还有PF4、PPBP等基因位点。

作者接着检查CXCL5、PF4、PPBP这三种趋化因子基因的表达水平及其与rs394408之间的关系来确定这些基因的表达对rs394408DNA变异的潜在影响。

图4D：观察到PF4和PPBP表达之间存在较强的的正相关(图4D)，而CXCL5和PF4或PPBP表达之间的相关性要小得多。

图4E-G：rs394408的CC基因型的CXCL5表达水平降低，而在PF4或PPBP表达则无统计学意义。

5.CXCL5基因多态性与CAD相关

图5.在SAMARA队列中，CXCL5基因与CAD相关

图5A、C：展示SAMARA队列中rs394408的基因型情况，T为次等位基因（A图:S1、S2分期对比展示；C图：整合了两个分期进行展示）。

表4：发现在没有阻塞性CAD的样本中更普遍的是次等位基因，OR值提示为优势因素。

图5B、D：基因型TT样本的CXCL5表达水平最高，其次为TC、CC。

图5E：SAMARA队列中阻塞性CAD样本的CXCL5表达降低。

图5F：CAD高分期的CXCL5表达降低。

表4.rs394408的次等位基因与不是阻塞性的CAD的关系

6.确定队列中CXCL5相关CAD的分子表型

表5.基因的ORA法分析

图6.CXCL5水平相关的eQTL和CAD严重程度的关系

图6A：CXCL5和CAD基因列表取交集，识别出253个与CXCL5水平和CAD严重程度相关的探针。

图6B：重叠的253个基因探针显示CXCL5水平与CAD严重程度呈负相关。两个基因簇(虚线圆圈)针对不同的基因集进行了富集（ORA法）。

图6C：热图表示的是在SAMARA队列中18个eQTLs的相关基因表达。

表6：作者接着使用线性模型关联统计方法，从18个位点中鉴定出30个cis eQTLs。

表6.CAD基因中发现的Cis-eQTL

图7.CXCL5相关的eQTL和CAD严重程度的关系

图7A：16号染色体LPCAT2位点的6个eSNPs的连锁不平衡分析；发现了两个相关的SNPs簇（i和ii）；也显示了LPCAT2的四个eQTLs所在的组织。

图7B：对eSNP rs12708952(左)和rs11646643(右)的eQTL分析。

图7C：阻塞性患者的LPCAT2表达升高；CAD高分期的LPCAT2表达也升高。

图7D：由于LPCAT2编码一种合成甘油磷脂前体的酶，能促进血小板活化因子产生。所以作者接着将QTL和相关分析扩展到血小板计数和PF4表达水平，来确定rs12708952的变化是否与血小板水平改变或血小板激活有关。但结果显示无统计学意义。

小结

作者基于以往研究结果筛选了CXCL5来研究是否为CAD的新靶点。作者利用定序和无序的logistic回归，作者控制包括性别、他汀类药物使用、高血压、高脂血症、肥胖等协变量，OR仍提示为优势因素。接着探讨了CXCL5水平与CAD score的关系；然后作了本文关键的eQTL分析，探讨CXCL5水平与基因表达的关系，从而鉴定了数量性状表达位点rs394408。作者还鉴定了18个基因区域，这些基因的eQLT与冠心病严重程度和CXCL5水平相关，为冠心病的治疗提供了新的靶点。

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