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一、研究背景
黑色素瘤（SKCM）是一种常见于皮肤的恶性皮肤癌，它的主要治疗方法是手术切除和放射治疗、化疗，但常规化疗和放疗的耐药性很常见。G9a作为组蛋白甲基转移酶在肿瘤发生中的作用的证据已经越来越多，因此作者希望在本项研究中证明G9a在SKCM细胞中的作用是经由Notch1通路介导的，同时证明G9a的抑制剂UNC0642可以作为黑色素瘤患者的潜在治疗方案。
二、分析流程
三、结果解读
1、验证G9a上调与癌症进展有关
图1.A：作者首先利用GEPIA数据库的在线工具对G9a在SKCM患者中的表达水平进行分析，发现与正常皮肤样本相比，原发性SKCM样本的G9a表达量明显较高
图1.B：作者进行KM生存分析，图中结果反应了G9a与SKCM较差的生存结果有关
图1.C-E：用siRNA敲除G9a后，利用CCK8试剂盒检测si-G9a组与对照度的细胞增殖速度，发现si-G9a组的细胞增殖速率显著降低，说明了G9a对细胞增殖的促进（图1.C）
同时为了验证这一结果，作者使用携带sh-G9a序列的慢病毒转染M14和A375两种SKCM细胞株，发现在两种细胞中sh-G9a组的克隆细胞数量只有对照组的40%，进一步验证了G9a对细胞增殖的促进（图1.D、E）
图1.F-I：作者进行transwell实验来判断G9a对SKCM的侵袭和转移表型的影响，如图1F-I所示，与对照组相比si-G9a组细胞的侵袭和转移能力明显降低，提示G9a对SKCM细胞侵袭和迁移的促进作用。
图1.G9a与黑色素瘤细胞增殖、侵袭、转移表型有关
2、G9a与PI3K/AKT通路和EMT相关通路的关系
图2是Western Blot的结果，从B、C、D三幅柱状图可以看出，在siG9a组中E-cad（E-钙黏蛋白）表达上调，Snail-1（EMT通路中的转录因子）表达下调，而p-AKT水平下降，说明G9a对PI3K/AKT通路和EMT（上皮间充质转化）相关通路都起到了促进作用
图2.WB检测PI3K/AKT和EMT通路明星分子受G9a的影响
3、证明G9a对Notch1的表达上调
先前已经有研究证明Notch1通路是黑色素瘤细胞中的关键信号传导过程，因此作者希望将G9a与Notch1对SKCM进程的推动作用相关联。
图3.A-B：利用GEPIA数据库对G9a和Notch1的表达进行相关性分析，图中结果显示二者呈现中度相关（R=0.6），这一结果提示了G9a与Notch1在黑色素瘤发展过程中可能存在相互作用
图3.C-E：利用Western Blot分析敲除G9a对Notch1的影响，发现si-G9a组细胞中的Notch1和Hes1蛋白水平明显下降，而底物H3K9me2含量升高，这说明G9a的敲除引起了Notch1相关通路的表达下调
图3.F-I：为了图2和图3.C-E得到的结论相关联，探讨G9a对PI3K/AKT的促进作用是否依赖于Notch1，作者对已经敲除了G9a的细胞进行NICD（Notch1的活性形式）的异位表达，以只敲除了G9a的si-G9a组作为对照，WB的结果表明：NICD的异位表达会抵消掉si-G9a组的p-AKT低表达，也就是说NICD发生异位表达就会阻断G9a对PI3K/AKT通路的上调。
图3.J中作者进行免疫组化实验（IHC）检测SKCM样本中的Notch1和p-AKT水平，来对上述结论进行验证。图3.K中表格给出的数据显示：Notch1阳性组织中的p-AKT阳性率为94.23%，明显高于Notch1阴性组织中的p-AKT水平（61.53%）。由此作者得出G9a可以通过激活Notch1来上调PI3K/AKT通路
图3.WB结合IHC验证G9a经由激活Notch1上调PI3K/AKT通路
4、G9a抑制剂UNC0642对Notch1的影响
图4.A：用不同浓度的UNC0642培养A375细胞株，并绘制了存活细胞数量随UNC0642浓度变化的曲线，发现当浓度超过0.5μM时，A375的细胞数量随着UNC0642浓度的提高而减少。
图4.B-F：对加入了UNC0642的M14细胞株进行WB检测，发现UNC0642组细胞的Notch1和Hes1蛋白水平明显降低。
图4.G-H：利用CCK8试剂盒检测UNC0642处理的M14和A375细胞的增殖水平，两图结果显示UNC0642可以明显抑制SKCM细胞的增殖
图4.WB检测UNC0642对Notch1间接抑制作用
5、验证UNC0642对SKCM的治疗效果经由Notch1介导
作者发现了UNC0642对SKCM细胞增殖、侵袭、转移三个表型的抑制作用，所以在图5、图6中作者希望证明UNC0642的治疗效果是通过抑制G9a的表达，进而下调了Notch1来实现的。
图5.A-B：作者设置了对照组、UNC0642处理组、和UNC0642处理+NICD异位表达组，经CCK8试剂盒检测发现：UNC0642处理过的细胞的存活数量显著下降，但在此基础上进行NICD的异位表达可以抵消UNC0642对增殖的抑制效果。
图5.C-H：作者进行transwell实验评价UNC0642对SKCM细胞侵袭和转移表型的影响，实验组设置与上述实验相同，图中结果表明：UNC0642的处理使M14和A375细胞株的侵袭和转移细胞明显减少，但在进行NICD异位表达之后细胞侵袭和转移的水平基本恢复。总之，以上实验结果说明了G9a可以通过Notch1通路调节黑色素瘤细胞的增殖、侵袭、转移。
图5.CCK8检测和transwell实验结果（UNC0642处理）
为了避免上述结论因为UNC0642存在除了G9a以外的其他靶点而出现不准确性，作者将图5中两个实验中的UNC0642处理操作全部换成了用siRNA敲除G9a，然后进行了与图5完全一致的实验操作，得到了一致的结论，使上述结论更加准确、有说服力。
图6.CCK8检测和transwell实验结果（si-G9a处理）
6、UNC0642经由Notch1介导细胞凋亡
图7.A-B：作者利用流式细胞术分析观察到UNC0642处理的细胞出现凋亡比率增加，而NICD的异位表达可以逆转这一现象。
图7.C-D：作者利用WB检测与细胞凋亡相关的明星分子Caspase-3和Bcl-2的蛋白水平，发现UNC0642处理的细胞中Caspase-3表达显著增加，而Bcl-2表达降低，而在此基础上进行NICD异位表达则可以逆转这一现象。
图7.E-H：将UNC0642处理更换为用siRNA敲除G9a重复上述的流式细胞术和WB检测，得到相同的结论，共同证明了UNC0642是通过抑制G9a，间接下调了Notch1，最终介导了SKCM细胞凋亡。
最后，作者在图7.I、J中进行了in vivo水平的实验，对裸鼠进行A375细胞的皮下注射，一周后开始每隔一天对实验组注射一次UNC0642，共注射10天后测量肿瘤体积，发现注射了UNC0642的小鼠的肿瘤体积比对照组更小，肿瘤的增长速度也明显更慢。这一步动物实验让针对G9a靶点的UNC0642可以作为黑色素瘤患者潜在治疗方案更具有说服力。
图7.流式细胞术结合WB检测UNC0642对SKCM细胞凋亡的影响
小结
本篇文章中作者利用GEPIA数据库分析、Western Blot、流式细胞术等多种实验方法，结合了正反回复实验的设置，并结合裸鼠SKCM细胞注射的动物实验验证，证明了G9a通过激活Notch1通路促进黑色素瘤的癌症进展，进而说明针对G9a靶点的抑制剂UNC0642可以作为黑色素瘤患者的潜在治疗方案。