一种提高柑橘中天然蜡质的方法及其应用与流程
本发明涉及柑橘生物学领域，具体涉及一种提高柑橘中天然蜡质的方法及其应用。
背景技术：
柑橘是重要的鲜食水果，以椪柑(Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan)为代表的宽皮柑橘类、以沙田柚(C.grandis Osbeck cv.ShatianYu)为代表的柚类和柠檬(C.limon cv.Eureka)为代表的枸橼类在中国乃至全球柑橘产业中占有十分重要的地位。
植物表皮角质层由角质和蜡质组成，是覆盖在所有陆生植物与空气接触部位的一层疏水性屏障。植物表面蜡质具有阻止植物组织内部非气孔性失水、防紫外线伤害、维持表面清洁与表面放水、抵御病虫害侵袭等功能，对植物适应外界环境起到非常重要的作用。柑橘的蜡质层是植株自我保护的第一道屏障，蜡质层具有阻止组织水分散失，维持表面清洁和光滑度，抵御病菌和昆虫侵害等功能。
另外，柑橘果实是重要鲜食水果，鲜食柑橘果实采收后通常需要经过洗果和单果包装(或打蜡)等商品化处理才能进入销售市场。打蜡流程复杂、成本较高，存在使用染色等添加剂、工业蜡和劣质蜡等行为。打蜡方式不当导致果实产生异味，这种差异主要源于天然蜡质和人工合成蜡质之间成分和结构差异。
目前，缺乏有效改善柑橘天然蜡质合成实现提高柑橘植株抗性以及采后果实保鲜性能的相关报道。
技术实现要素：
本发明为了解决现有技术中无法简便、有效地提高柑橘天然蜡质合成的问题，提供了一种提高柑橘中天然蜡质的方法，有效的促进柑橘叶片和果实的天然蜡质合成量，提高植物抗性，改善采后柑橘的贮藏保鲜性能。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明一种提高柑橘中天然蜡质的方法，其特征在于，当柑橘新梢抽梢12～15d时，向柑橘叶片喷施0.1～200μmol/L的吡草胺溶液。
优选的，所述吡草胺溶液的浓度为50～180μmol/L。
优选的，所述吡草胺溶液的溶剂包括乙醇和水，乙醇与水的体积比例为1:299～599。
优选的，所述吡草胺溶液喷施的次数为1～7次。
优选的，所述吡草胺溶液的单次喷施量为25～40mL/株。
本发明还提供了上述技术方案所述的方法在提高柑橘植株抗性中的应用。
本发明还提供了前述技术方案在提高柑橘果实的采后贮藏保鲜能力中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
本发明提供了一种提高柑橘中天然蜡质的方法，当柑橘新梢抽梢12～15d时，向柑橘叶片喷施0.1～200μmol/L吡草胺溶液。本发明研究表明，停止喷施吡草胺溶液的2周后，待植株和果实恢复生长后显示其表面晶体补偿性增多(即天然蜡质合成增多)，蜡质合成通路的基因表达量显著提高，有效增加了柑橘叶片和果实表面的光泽度和光滑度，进而对于植物抗性以及柑橘采后果实的保鲜性能均有显著提升。
本发明研究表明，采用本发明所述方法对柑橘进行处理后，柑橘天然蜡质合成通路中的3-β-酮酰CoA合成酶(KCS)的基因表达量与正常植株相比有显著增加。KCS参与柑橘天然蜡质合成途径中的超长链饱和脂肪酸(VLCFAs)生成反应，即以丙二酰-CoA为底物，催化C16或C18脂肪酸延伸缩合生成足够碳链长度的VLCFAs，KCS是决定这一催化反应的反应速度以及最终得到的酰基辅酶A产物酰基链程度的关键，本发明利用这种吡草胺处理方式有效了提高KCS的基因表达量，保证VLCFAs的多样性，通过有效地促进了VLCFAs这一天然蜡质合成前体物质生成速度的提高，达到提高天然蜡质含量的目的。在生成VLCFAs的反应中，与KCS共同参与FAE循环的β-酮酰基辅酶A还原酶(KCR)、β-羟酰基辅酶A水解酶(HCD)以及烯酰基CoA还原酶(ECR)的基因表达量与正常植株无显著差异。
本发明研究还表明，施用本发明所述浓度的吡草胺溶液后，柑橘天然蜡质合成通路中的CER4和CER3基因等相关基因的表达量有显著提高，表明本发明所述方法能够同时促进初级醇途径和烷烃途径合成蜡质的相关酶基因表达。
吡草胺的毒性低，易降解，半衰期在10.92～12.68d，当柑橘果实上市时基本上不会存在吡草胺残留，对人体安全。本发明提供的方法仅需喷施吡草胺溶液即可，成本低，简单易行，便于推广。
附图说明
图1为实施例1中不同处理下的柑橘幼苗生长状况；
图2为实施例1中不同处理下柑橘叶片显微镜放大图；
图3为实施例1中不同处理下柑橘蜡质合成途径相关基因表达量比较图；
图4为实施例2中不同处理下采后果实的腐烂情况。
具体实施方式
本发明提供了一种提高柑橘中天然蜡质的方法，当柑橘新梢抽梢12～15d时，开始向柑橘叶片喷施0.1～200μmol/L吡草胺溶液。
本发明的实施例结果显示，当吡草胺溶液喷施结束后，第2d起叶片中天然蜡质含量显著增多，蜡质晶体数量显著增加。
经过本发明所述方法喷施的幼嫩叶片与正常叶片相比面积稍小、叶片厚度增加、色泽更绿且更亮，而成熟叶片则与正常叶片在形态上无显著区别。本发明经过对比喷施本发明所述吡草胺溶液与清水喷施的柑橘植株果实，二者的柑橘果实表面色泽、外形无显著差异，并且无畸形果，即表明采用本发明所述方法后不会破坏柑橘果实的外形和商品价值。
本发明所述提高柑橘中天然蜡质的方法可用于柑橘幼苗和成熟植株。
本发明优选的在柑橘新梢抽梢13～14d时，向柑橘叶片喷施吡草胺溶液。本发明选择在新梢抽梢2周左右喷施吡草胺是为了在柑橘生长早期对天然蜡质合成途径进行干预，补偿性促进柑橘天然蜡质合成途径的相关基因大量表达，从而在后期能够持续大量地合成天然蜡质，提高总体天然蜡质含量。
吡草胺属于氯乙酰苯胺类除草剂，大鼠急性经口LD50为2150mg/kg，急性经皮LD50大于6810mg/kg，毒性较低。半衰期为10.92～12.68d，易于降解。本发明对所述吡草胺的来源无特殊限定，采用市售商品即可。
在本发明中，所述吡草胺溶液浓度优选为50～180μmol/L，更优选为100～150μmol/L。在本发明中，低浓度下(200μmol/L以下)的吡草胺溶液对柑橘天然蜡质合成途径相关基因如KCS、CER4以及CER3等的表达有显著促进作用，超出有效浓度范围则可能有抑制作用。
在本发明中，所述吡草胺溶液的溶剂包括乙醇和水，所述的乙醇和水作为溶剂，不具有促进柑橘天然蜡质合成的作用。本发明优选的，所述吡草胺溶液中，乙醇与水的体积比优选为1:299～599。
在本发明中，所述吡草胺溶液的制备方法优选为：用乙醇将吡草胺溶解，得到吡草胺母液；再将所述吡草胺母液用水稀释至吡草胺溶液浓度为0.1～200μmol/L。
在本发明中，所述吡草胺溶液的喷施次数优选为1～7次，更优选为2～5次。本发明优选的，当喷施次数为多次时，相邻两次吡草胺溶液的喷施时间间隔为1～5d，更优选为3～4d。本发明多次喷施吡草胺溶液的目的在于让植株树势恢复，促进植物自身脂肪酸代谢通路补偿性合成。
在本发明中，所述吡草胺溶液的单次喷施量优选为25～40mL/株，更优选为30～35mL株。
本发明在喷施时将柑橘植株的叶片正反面全部喷淋，以喷淋至有水滴滴下为止。
本发明还提供了上述方法在提高柑橘植株抗性中的应用，通过在柑橘新梢抽梢12～15d时，向柑橘叶片喷施0.1～200μmol/L吡草胺溶液来提高柑橘中天然蜡质提高柑橘植株对于病虫害侵袭的抵抗能力、不良环境的抵御能力等。
本发明还提供了前述方在提高柑橘果实的采后贮藏保鲜能力中的应用。本发明自柑橘新梢抽梢12～15d时，开始向柑橘叶片喷施0.1～200μmol/L吡草胺溶液，促进柑橘植株的天然蜡质合成量，使柑橘植株所结果实的天然蜡质含量增加，从而增强柑橘果实的采后贮藏保鲜能力。本发明研究表明，经过本发明所述方法处理的柑橘植株所结果实，4℃下贮藏2个月的腐烂率比常规柑橘果实降低了13.33％，可有效延长采后柑橘的保鲜时间，降低对人工打蜡等保鲜操作的需求。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、材料选择：选择生长2周的纽荷尔脐橙幼苗；
2、配制药剂：将吡草胺与无水乙醇混合，溶解配制成60mmol/L的贮存液。贮存液经清水稀释成100μmol/L的吡草胺溶液。
3、实验处理：选择两株大小相当的纽荷尔脐橙幼苗，在新梢抽梢14d时开始，分别以吡草胺溶液和清水喷施叶片，每次喷施30mL/株，每隔一天喷施一次，连续喷施7次(共2周)。
观察喷施过程中、停止喷施2周后的植物表面蜡质状况，测定蜡质含量以及蜡质合成通路相关基因的表达情况，生物学重复三次。
4、结果
(1)如图1所示，图中上部所示为清水喷施的柑橘幼苗生长状况，下部所示为100μmol/L吡草胺溶液喷施的柑橘幼苗生长状况。柑橘幼苗喷施吡草胺溶液时，幼苗叶片相对发黄，变厚和变小。当停止喷药2周后观察，喷施吡草胺的纽荷尔脐橙幼苗叶片生长势恢复且转绿，叶面变亮，但是面积小于正常叶片。
(2)如图2所示，AB为清水处理的柑橘叶片不同放大倍数下的显微镜观察图；CD为吡草胺处理的柑橘叶片不同放大倍数下的显微镜观察图；AC的放大倍数为2000倍，BD的放大倍数为5000倍。
停止喷施吡草胺溶液的2周后，叶片恢复生长，叶片变绿增厚，蜡质迅速增多。由图2可以看出，经过吡草胺溶液处理的柑橘叶片中晶体数量明显多于清水处理的柑橘叶片，即经本发明所述浓度的吡草胺溶液处理后叶片中蜡质晶体结构数量变多。通过统计学分析，晶体数量增加2倍之多。
(3)利用基因检测试剂盒对柑橘蜡质合成途径中相关的基因表达情况进行检测，即分别检测清水处理和吡草胺溶液处理停止2周后的柑橘叶片中KCS(3-β-酮酰CoA合成酶)、ACC(乙酰辅酶A羧化酶)、KCR(3-β-酮酰CoA还原酶)、HCD(β-羟酰基辅酶A水解酶)、ECR(烯酰基CoA还原酶)、CER(脂肪酰基还原酶)和MAH(中链烷烃羟化酶)的表达量，具体结果如图3所示。
图3所示的各柱状图中，非黑色表示喷施吡草胺的柑橘叶片中相关基因表达量，黑色则表示喷施清水的柑橘叶片中相关基因表达量，*表示p<0.05，**表示p<0.01，。
如图3所示，乙酰CoA通过乙酰CoA羧化酶(ACCase)的作用生成丙二酰-CoA，ACC1基因表达与乙酰CoA羧化酶相关，喷施吡草胺后的柑橘叶片中ACC1基因表达量显著高于清水处理，提高了用于合成蜡质直接前提物质VLCFAs(特长链包合脂肪酸)的原料。
3-β-酮酰CoA合成酶(KCS)参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应，具有底物特异性和功能冗余现象，保证VLCFAs的多样性；通过与清水处理叶片对比分析，吡草胺处理叶片KCS4、KCS6和KCS10基因表达量均上调2倍以上。3-β-酮酰CoA还原酶(KCR)、羟酰CoA脱水酶(HCD)和烯酰CoA还原酶(ECR)分别参与蜡质还原、脱水和烯基还原等反应，通过与清水处理叶片对比分析，吡草胺处理叶片以上的基因表达无显著性差异。
KCS、KCR、HCD和ECR共同催化VLCFAs的生成，其中KCS是合成VLCFAs的限速酶并能决定合成的碳链长度。本发明通过促进KCS表达的升高能够显著提高VLCFAs的含量，进而通过增加蜡质合成的前体物质提高最终合成的蜡质含量。
以VLCFAs为前体物质，存在两种蜡质合成途径，其一为初级醇途径，该途径中VLCFAs井脂肪酸还原酶FARs(CER4基因)被还原为初级醇，初级醇在蜡质合成酶(WS)催化下与饱和脂肪酸缩合形成烷基酯(蜡酯类)；其二为烷烃途径，该途径下VLCFAs在酯酰辅酶还原酶FAR(CER3基因)的作用下还原为醛，经醛脱羧酶催化脱羧生成烷烃，烷烃被中链烷烃羟化酶(MAH)催化生成二级醇，二级醇经MAH催化生成酮。
如图3所示，脂肪酸还原酶FARs(CER4)参与VLC-酰基CoA还原反应，生成以偶数碳链的伯醇；通过与清水处理叶片对比分析，吡草胺处理叶片的CER4的基因表达上调5倍以上。蜡质合成酶(WS)催化伯醇与碳链长度≥C16VCL-酰基CoA形成蜡酯类，通过与清水处理叶片对比分析，吡草胺处理叶片的WSD1的基因表达上调2倍以上。
如图3所示，酰基CoA还原酶(CER3)将长链脂肪酰基CoA形成中间状态的超长链酰基醛类，吡草胺处理CER3表达量上调7.41倍；CER1将醛类物质脱羧形成超长链烷烃，吡草胺处理表达量上调2.33倍。
可见，经过吡草胺处理后能够显著提高柑橘的蜡质合成相关基因表达量，促进天然蜡质合成，进而提高柑橘植株的抗性。
实施例2
1、材料选择：选择三年生的山金柑植株(挂果)；
2、配制药剂：将吡草胺与无水乙醇混合，溶解配制成60mmol/L的贮存液。贮存液经清水稀释成200μmol/L的吡草胺溶液。
3、实验处理：选择3株大小相当的山金柑，挂果量约为10个左右，果实处于绿熟时期。分别用吡草胺和清水溶液喷叶片，每隔3天喷药30mL/株，连续喷5次。
处理结束后，观察果实生长情况，统计畸形率；
果实成熟后，将采摘的柑橘果实在4℃下低温贮藏2个月，观察贮藏期间的果实变化情况，并统计贮藏后的果实腐烂率。
4、结果
(1)观察至第二年2月，挂果期间和采摘后的果实畸形率无显著差异。
(2)采摘后果实表面色泽和外形与清水处理果实无显著差异。
(3)如图4所示，A为清水处理的采后果实贮藏腐烂率，B为吡草胺处理的采后果实贮藏腐烂率，*表示p<0.05。
由图4可知，吡草胺处理的腐烂率比清水处理的降低了13.33％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。