干货丨揭开数字PCR的面纱，认识一下“她”
来源：小桔灯网
摘要
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）大流行导致了公共卫生危机和全球恐慌，到目前为止确诊人次已经超过二亿二千万例。Delta、Lambda新冠变异病毒已经出现在全球90多个国家。如何快速准确诊断病毒特别是变异株，对治疗和防疫工作具有重要意义。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是国内应用最广泛的新冠检测技术。在疫情防控工作中，不同的核酸检测技术也得到了快速的发展，包括数字PCR（dPCR），逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）和转录介导扩增（TMA）等。dPCR是一种新兴的核酸扩增技术，允许绝对定量核酸。它具有灵敏度高、精度高、抗干扰能力强等优点。
01
什么是数字PCR
数字PCR技术也称为第三代PCR技术，是一种核酸高灵敏检测和绝对定量的新方法。同传统的PCR相比，数字PCR增加了对反应体系进行分隔（Partition）的操作，将几十微升的反应体系分隔成了数万微小独立反应体系，核酸模板在这种分隔过程中被充分稀释，理想状态下每个微滴中含有1个分子的核酸模板，扩增完成后对所有的液滴进行荧光信号识别并计数，计算出阴性和阳性反应的数量，通过泊松分布原理计算靶标分子的浓度。从而实现靶标分子的绝对定量。数字PCR不依赖标准曲线定量，并且不受PCR扩增效率影响，具有更高灵敏度和准确度。
图1 数字PCR的原理示意图
图片来源于Naica，侵删
02
数字PRC的由来
20世纪末，Bert Vogelstein等人在美国科学院院刊PNAS上首次提出了数字PCR(Digital PCR, dPCR)的概念，并表明该技术可用于研究罕见的癌症突变。
Bert Vogelstein
◇ 2003年，Kinzler和Vogelstein继续完善dPCR，并创建了一种改进的方法，他们将其称为BEAMing技术，即“珠子，乳状液，扩增和磁性”的首字母缩写。BEAMing技术使用乳状液在单个试管中分隔扩增反应。这一变化能在一次运行中将该PCR扩展到成千上万的反应。
随着纳米制造技术和微流体技术（nanofabrication and microfluidics）的发展，数字PCR技术遇到了突破瓶颈的最佳契机。
◇ 2006年，Fluidigm公司推出了第一台商业化的基于芯片的商品化数字PCR系统，Fluidigm的IFC平台使用物理矩阵的策略，他们的qdPCR 37K系统“集成电路”利用该公司的微流控专长，可将48个样品逐个分布在770个微反应单元中。
◇ 2013年，Life technologies推出了QuantStudio3D数字PCR系统。采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20000个单独的反应孔中。在整个工作流程中，样本之间保持完全隔离，可以有效防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计避免了微滴式系统可面临的管路堵塞问题。
◇ 目前，dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和微滴式三大类系统。目前，市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系统和Thermo Fisher公司的Quant Studio系统等。
表1 数字PCR分类及特点
03
数字PCR的优势
数字PCR是生命科学领域最引人瞩目的创新之一。与其他传统分子诊断技术相比，数字PCR技术的优势在于:
➣ 高灵敏度，可实现单分子级检测
图片来源于Naica，侵删
dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应， 在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。
➣ 高精度，可检测微小差异
图片来源于Naica，侵删
在大量野生型基因存在的情况下精准地检测低含量的突变基因是目前的研究难点之一，竞争性反应严重影响突变基因的检测。dPCR技术从背景序列中检测低丰度目的序列的能力和高灵敏度的特点使得这一技术特别适合在复杂背景中检测稀有突变。
➣ 绝对定量，不依赖标准品和参考曲线
图片来源于Naica，侵删
数字PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。
➣ 高重复性，消除扩增效率偏差影响
图片来源于Naica，侵删
FAM、HEX和Cy5通道浓度平均值和CV值的数据表明， 在所述的实验条件下，三种测试浓度之间没有统计学差 异(p<0.05)。
➣ 强耐受抑制物，适用于多种复杂样本
图片来源于Naica，侵删
血液、粪便、食品、土壤等样本中含有大量PCR反应的抑制物，极大地影响 了PCR反应效率。另外，在某些检测中，难以制备测定标准曲线所需的标准物质。dPCR不受PCR抑制物的影响、不依赖标准曲线的优势，使其特别适合于这些复杂样本中基因表达的准确定量检测。
表2 数字PCR与qPCR核酸检测技术对比
04
应用领域
科学界对于数据准确性和结果可靠性的要求越来越高，更多的实验室将目光转向拥有绝对定量方式、高灵敏度和高重复性特质的数字PCR技术。dPCR作为一种新兴的靶核酸绝对定量技术，对低丰度DNA具有高度的敏感性和特异性，对扩增抑制剂具有高度的抗性。因此，dPCR可用于低拷贝病毒的检测、病毒载量的测定、标准物质的制备、环境中病毒浓度的监测、病毒变异的检测和SARS-CoV-2药物的评价。