黄精褐斑病的病原生物学特性
黄精褐斑病的病原生物学特性网络首发论文
黄精 Polygonatum sibiricum Red.为百合科Liliaceae 黄精属 Polygonatum Mill.多年生草本植物，广泛分布于我国除南方热带以外的广大地区（中国科学院中国植物志编辑委员会 1978）。传统医学认为，黄精具有补肾益精、滋阴润燥之功效，长期用于治疗肾虚亏损、体倦乏力等症（陈晔和孙晓生 2010；Xian et al. 2012）。现代医学研究发现，黄精还具有抗衰老、提高免疫力、调节造血能力、消炎、抗肿瘤和降血糖等多种功效（Kato et al. 1994；王慧等 2017）。近年来，随着黄精研究的深入及应用领域的拓展，该药材需求量日益增大，因此，黄精中药材人工栽培面积不断扩大（杨子龙等 2002；张平 2002）。在黄精栽培过程中由于管理不当、种植年限延长等因素，导致叶斑病、叶枯病、炭疽病和茎腐病等多种病害逐年加重，这些病害多发生在 7–9 月，严重影响到黄精根状茎的产量和品质（田启建和赵致 2006；周先治等 2018）。目前，对黄精病害的发生与防控方面的研究还相对有限。
2017 年 7 月，作者在贵州省施秉县牛大场镇中药材基地栽培的黄精植株上发现了一种叶部新病害，主要危害黄精叶片，病部产生椭圆状褐色斑点，有黄色晕圈，严重时病斑连成一片造成叶片坏死。该病害发展迅速，严重时可引起植株地上部分枯死，显著降低了药农的经济收益，制约了当地黄精产业的发展。为明确该病的病原菌，本文对该病害进行了病原分离鉴定和致病性测定并研究了病原菌的部分生物学特性，以期为当地黄精叶斑病害的发生和综合防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 病害样品采集
2017 年 7 月，在贵州省施秉县牛大场镇中药材基地中采集具有典型发病症状的黄精叶片样品，带回实验室备病原菌分离培养。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、查氏琼脂（Czapek）培养基、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基、水琼脂培养基（WA）和燕麦片琼脂（OMA）培养基（方中达 1998）。
1.3 病原菌的分离与形态学鉴定
采用组织分离法（方中达 1998）从黄精叶片的病健交界处切取 5mm×5mm 小块组织，在75%酒精中浸泡 10s 后，于 0.1%升汞中浸泡3min，再用无菌水将组织冲洗 4 次，最后用无菌吸水纸吸干，将其接种至加有微量链霉素、青霉素的 PDA 平板上，每个平板接 3 块，于 25℃培养 5d 后挑取菌落边缘少量菌丝体进行转接培养，并进行单孢分离获得纯培养物（代表菌株HGUP17281），该菌株于 25℃培养 7d 后，进行菌落观察和显微微形态观察。
1.4 致病性测定
在 2018 年 7 月，选取 1 年生新鲜健康黄精叶片，用无菌水冲洗干净，用脱脂棉包裹叶柄处后放置于加有滤纸的培养皿（d=9cm，下同）中，皿底加适量水润湿。将菌饼（d=5mm，下同）接种于经接种针（已灭菌）划伤的叶片（菌落正面紧贴在叶片伤口处），每叶接种 2 个菌饼，共 3 个重复处理。以接种无菌菌饼的叶片作为对照。将各处理置于室温（25℃）保湿培养。接种 2d 后开始观察发病症状，7d 后除去菌饼，记录病斑大小和颜色。待接种叶片发病后再进行分离培养（徐海娇等 2017）。
1.5 病原菌分子生物学鉴定
菌株经 PDA 培养后收集菌丝体，采用Biomiga Fungal gDNA Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取供试菌株基因组 DNA，选择引物 ITS（ITS1/ITS4）、β-tubulin（Bt2a/Bt2b）、tef1 （EF1-526F/EF1-1567R） （Maharachchikumbura
et al. 2012）进行 PCR 扩增。反应体系为 20μL：10×PCR 反应缓冲液 2μL，dNTPs（10mmol/L）1.6μL，引物（10μmol/L）各 0.5μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL，DNA 模板 1μL，ddH 2 O 补足 20μL。ITS-PCR 反应条件：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，52℃退火 45s，72℃延伸 90s，35个循环；72℃延伸 10min。tef1 基因 PCR 反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 30s，63–53℃或 66–56℃（每循环降低 1℃）退火 45s，72℃延伸 90s，36 个循环；72℃延伸 7min。β-tubulin基因 PCR 反应条件：95℃预变性 3min；95℃变性 1min，55℃退火 50s，72℃延伸 1min，35 个循环；72℃延伸 10min。反应产物经 1.2%的琼脂电泳检验，将 PCR 产物送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）数据库中进行 BLAST比对分析后提交到 GenBank。
从相关参考文献搜集模式菌株信息，并从 GenBank 中分别下载其对应的基因序列（Maharachchikumbura et al. 2014；冉双飞2017） ，用 Bioedit 比对目标序列（ClustalWMultiple alignment）后转换为 Fasta 文件，用系统发育分析软件 PAUP* 4.0 Beta 10 运行此文件，执行最大简约法的分析运算（Swofford 2002）。
1.6 病原菌生物学特性研究
1.6.1 碳、氮源对菌丝体生长的影响：以查氏培养基为基础培养基，用等量的碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、D-果糖）及氮源（酵母浸膏、L-苯丙氨酸、蛋白胨、半胱氨酸）分别替代基础培养基中的蔗糖和硝酸钠，以不含碳源及氮源的培养基为对照，取菌饼接种于各培养皿中央。所有处理组均 3 个重复，25℃恒温培养，7d 后用十字交叉法测量菌落直径（秦人全等 2017），下同。
1.6.2 温度对菌丝体生长的影响：在 PDA 培养基上接种病原菌，分别置于 5、10、15、20、25、30、35 和 40℃共 8 个温度中恒温培养。
1.6.3 pH 对菌丝体生长的影响：用 1 mol/L 的 HCL和 1 mol/L 的 NaOH 溶液将 PDA 的 pH 值分别调节至 4、5、6、7、8、9、10，共 7 个处理，接种菌饼。
1.6.4 光照对菌丝体生长的影响：将接种了菌饼的 PDA 置于完全黑暗、12h 明暗交替和完全光照3 个条件下培养。
1.6.5 培养基对菌丝体生长的影响：将菌饼分别接种至 PDA、PSA、WA、Czapek、OMA 和 MEA培养基上进行培养。
1.6.6 病原菌致死温度测定：在盛有 5mL 无菌水的试管中加入病原菌，分别在 40、45、50、55、60、65℃的恒温水浴锅中加热 10min，迅速冷却后接种在 PDA 上，25℃恒温培养，逐日观察菌丝体生长情况。用 Excel 表格工具和 IBM SPSSStatistics 软件对以上测量数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 黄精褐斑病症状
病斑呈圆形或不规则形，边缘棕褐色至暗褐色，中间淡褐色并着生黑色小点（子实体），带有黄色晕圈（图 1A，B）；发病严重时，病斑中央组织坏死呈薄膜状或穿孔，多个病斑能汇合形成大面积枯死斑，最终导致植株地上部分枯死（图 1C）。
A：正面病斑；B：叶背病斑；C：田间自然发病症状. D，G：接种叶片发病症状（7d）；E，H：划伤接种无菌菌饼的叶片（7d）；F，I：健康黄精叶片
2.2 致病性测定
对 7 片黄精叶片的 13 块叶片病健交界组织中分离获得了 9 个优势菌株，根据菌落形态特征和显微形态特征将这些菌株鉴定为一个类群，分出率为 69.23%（代表菌株 HGUP17281）。经致病性测定，发现划伤接种 3d 后叶片开始发病，产生边缘深褐色、中间淡褐色的病斑，直径0.12–0.15cm；接种 7d 后，病斑扩大，直径0.54–1.52cm，病斑边缘出现黄色晕圈（图 1D，1G）。划伤不接菌的对照叶片在 7d 后仅出现机械损伤（图 1E，1H）。经对显症部位再次进行病菌分离培养，再次得到形态一致的病菌。试验结果表明菌株HGUP17281是黄精褐斑病的致病菌。
2.3 病原菌的形态学鉴定
病原菌在 PDA 上，25℃黑暗培养 7d，菌落直径达 7.0cm；菌丝体白色、絮状，背面淡黄色（图 2A，B）；15d 后菌落正面出现黑色分生孢子盘，上生分生孢子粘液团（图 2C）；产孢细胞无色透明，棒状，12.54–25.41×2.11–4.69µm（图 2D-E）；分生孢子纺锤形或梭形，直立或稍弯曲，18.72–24.50×4.10–5.30µm，具 4 隔膜，分隔处缢缩，中间 3 个细胞浅褐色，细胞壁较厚；两端细胞（顶细胞和基细胞）无色、锥形，细胞壁薄；顶部附属丝2–3根一簇，长11.70–17.20µm，底部附属丝单生，长 3.10–6.50µm（图 2F）。根据以上形态学特征，将病原菌 HGUP17281 鉴定为拟盘多毛孢属 Pestalotiopsis 真菌。
A-B：菌落形态（PDA，7d）；C：分生孢子盘（PDA，15d）；D，E：分生孢子盘（15d）；F：分生孢子（15d）.标尺：C=200μm；D，E=30μm；F=20μm.
2.4 病原菌的分子生物学鉴定
对供试菌株的 rDNA-ITS、β-tubulin 和 tef1基因进行扩增和测序，分别获得 540bp、425bp、927bp 的基因片段，将序列提交至 GenBank 数据库 ， 分 别 获 得 序 列 登 录 号 为 MH660397 、MH660395、MH660396。通过系统发育分析，供试菌株HGUP17281与Pestalotiopsis trachicarpicolaY.M. Zhang & K.D. Hyde（菌株号分别为 12-0267、OP068）菌株聚于同一分支，且支持率达 100%，与其他种类明显不同。因此，结合菌株的形态特征，将黄精褐斑病病原菌 HGUP17281 鉴定为棕榈拟盘多毛孢 P. trachicarpicola。
图 3 基于 rDNA-ITS、β-tubulin、tef1 序列构建菌株 HGUP17281 的多基因系统发育树
分支上的数据表示 Bootstrap 检验的支持百分率，自展支持值（Bootstrap）>50%的显示在各个进化分支节点上，Neopestalotiopsis saprophytica 作为外群，HGUP 17281 是试验菌株
2.5 病原菌生物学特性研究
2.5.1 碳、氮源对菌丝体生长的影响：试验结果表明（图 4A，4B），供试的 5 种氮源和碳源均能促进病原菌生长，但存在明显差异，其中最适宜的碳源和氮源分别是葡萄糖和酵母浸膏。
2.5.2 温度对菌丝体生长的影响：试验结果表明（图 4C），病原菌菌丝体的适宜生长温度为15–30℃，其中最适生长温度为 28℃。当温度低于 15℃或高于 30℃时菌丝体生长迟缓甚至停止。
2.5.3 pH 对菌丝体生长的影响：试验结果表明（图 4D），病原菌在 pH4-10 范围内均可生长，但最适 pH 为 5。总体来说，菌丝体在偏碱性条件下生长比较缓慢，而在偏酸性条件下相对有利于菌丝体生长。
2.5.4 光照对菌丝体生长的影响：试验结果显示（图 4E），24h 持续光照、24h 持续黑暗、12h光暗交替处理下各菌落直径无显著差异。不同光照处理对病原菌菌丝体生长无显著影响。
2.5.5 培养基对菌丝体生长的影响：试验结果表明（图 4F），该菌在 WA 之外的 5 种供试培养基上均能生长。其中 PDA 最适于菌丝体生产，其次为 PSA、Czapek 培养基（6.83–7.34cm），而OMA 和 MEA 培养基相对较差。
2.5.6 病原菌菌丝体致死温度：病原菌经 40℃处理 10min 后接种于 PDA 培养基上仍能继续生长，但温度高于 45℃时 10min 后无法生长，由此确定该菌菌丝体的致死温度是 45℃。
3 讨论
黄精叶斑类病害是危害黄精的重要病害，当前，国内对黄精叶斑类病害的研究报道有限，田启建等（2008）和邹娟等（2018）分别报道了链格孢属 Alternaria sp. Septoria sp.和草茎点霉Phoma herbarum 可引起黄精的叶斑病和黑斑病。此次研究将黄精褐斑病的病原鉴定为棕榈拟盘多毛孢 P. trachicarpicola，是一种新发现的黄精叶斑病病原。此次生物学特性研究结果显示该病原较适宜在 pH 值 5，加酵母浸膏的 PDA 培养基中于 28℃恒温环境下培养。这些研究结果与葛起新等 （2009）和石凌波（2017）的研究结果基本一致。
A：碳源处理；B：氮源处理；C：温度处理，x：℃；D：pH 处理；x：pH 值；E：光照处理；F：培养基类型，y：菌落直径（cm），数据后不同字母表示差异显著（P<0.05）
拟盘多毛孢属Pestalotiopsis真菌寄主范围广，部分种有致病性，如 P. uvicola 危害葡萄的叶片、树皮和果实（Sergeeva et al. 2005；Urberz-Torres etal. 2012），近年来发现 Pestalotiopsis 属部分真菌也引起植物的叶斑类病害（Maharachchikumburaet al. 2014），如拟盘多毛孢 P. clavispora 引起草莓叶斑病（赵景楠等 2016），P. longiseta 引起野茶树Camellia sinensis 的灰斑病（Maharachchikumbura etal. 2013）。部分非致病种是植物的内生菌，其中某些种如 P. mirospora 和 P. neglecta 的次生代谢物具有抗菌活性，具有一定的医学研究价值（Strobel et al. 2002；Sharma et al. 2016；Sessa etal. 2018）。
棕榈拟盘多毛孢 P. trachicarpicola 能寄生于棕 榈 Trachycarpus fortunei （ 云 南 昆 明 ） 、Chrysophullum sp.（云南昆明）、木荷 Schima sp.（湖南宜章县）、山矾 Sympolocos sp.（湖南宜章县）等多种植物的叶片上（Maharachchikumbura2012）。对部分植物有致病性，但相关报道较少，已知能引起棕榈、杜仲 Eucommia ulmoides 等植物的叶斑病（Zhang et al. 2012；Li et al. 2018），也是葡萄枝干病害和果实软腐病的弱致病种（Jayawardena et al. 2015）。Maharachchikumburaet al（2016）从法国葡萄种植区发病的葡萄树干中分离出一株棕榈拟盘多毛孢 P. trachicarpicolaICMP20420，但未记载致病性相关测试。
传统形态学通过分生孢子、顶端附属丝或培养性状的形态差异等特征确定拟盘多毛孢Pestalotiopsis 的种类，由于这些表征的形态较为接近，界限模糊，给 Pestalotiopsis 属真菌的种类鉴定带来一定的困难（Maharachchikumbura et al.2011）。为更好地区分 Pestalotiopsis 属的部分近缘种，Jeewon et al（2003）使用 ITS 序列评估了Pestalotiopsis 在分类学方面的系统发育特征，Huet al（2007）的研究显示 TUB（β-tubulin）基因能更好地将 Pestalotiopsis 属真菌鉴定到种，并提出至少联合 ITS 与 TUB 两种基因片段区别Pestalotiopsis 的物种，Maharachchikumbura et al.（2012）用肌动蛋白、钙调素、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、ITS、LSU、18S nrDNA、RNA 聚合酶 II，TEF 和 TUB 等 10 个基因区确定 Pestalotiopsis 的种间区别，确定了 ITS，TUB 和 TEF 是较好的分子标记。本次实验参考 Maharachchikumbura et al. （ 2012 ） 对Pestalotiopsis 的分类研究结果，联合 ITS、β-tubulin 和 tef1 3 段基因进行系统发育分析，确定黄精褐斑病的病原菌为棕榈拟盘多毛孢Pestalotiopsis trachicarpicola。
生 物 学 特 性 的 初 步 研 究 结 果 表 明 P.trachicarpicola 是喜高温菌，适宜在高温偏酸土壤环境中生长，较容易在贵州等我国南部地区发生。在生产上可以通过适当遮荫、土壤中增施石灰和磷钾肥来控制褐斑病的发生。本研究新发现了一种黄精叶斑类病害病原菌，并初步研究了其部分生物学特性，可为该病的田间监测、发生和防治提供一定参考。