益生菌对重症感染性肺炎患儿血糖的稳定作用及其机制研究
王玉，杨中文，史长松，张豫华，高丽
郑州大学人民医院
河南省人民医院
目的：探讨益生菌对重症感染性肺炎患儿血糖水平的调节及作用机制。
方法：前瞻性纳入重症感染性肺炎患儿80例，随机分为两组，对照组给予常规治疗，治疗组采用常规治疗加用益生菌。两组患儿分别于入组当天和治疗第8天监测血糖浓度，并测定血浆硫化氢、D-乳酸以及粪便短链脂肪酸（乙酸、丙酸、正丁酸）水平，同时观察两组患儿的血糖变化、波动情况和结局，并进行分析。
结果：两组患儿入组当天的各项指标均无显著差异（P＞0.05）。治疗第8天时，治疗组患儿血浆硫化氢浓度和粪便中乙酸、正丁酸水平明显高于对照组（P＜0.05）；同时，治疗组患儿血浆D-乳酸浓度也较对照组明显降低（P＜0.05）。治疗第8天，治疗组患儿的血糖水平和高波动比例显著低于对照组（32.5%，P＜0.05）。治疗组患儿的临床治愈率也明显高于对照组。而且血糖浓度与硫化氢、乙酸水平呈明显负相关，与D-乳酸浓度呈显著正相关（P＜0.05）。
结论：重症感染性肺炎患儿应用益生菌可调整肠道菌群结构，加强肠道屏障功能，增加血浆硫化氢的浓度，调节和稳定血糖水平，并改善临床结局。
通讯作者：史长松（scs7682@126.com）
原文参见：肠外与肠内营养. 2017;24(3):159-163.
20世纪90年代以来，多项临床研究发现，应激性高血糖不仅是成人外科、内科，同时也是儿科重症患者中常见的病理生理紊乱，其可对临床结局造成严重的不良影响，包括增加病死率、器官功能障碍患病风险等【1】。
硫化氢是继一氧化氮和一氧化碳之后被发现的第三个气体信号分子，生理水平的硫化氢具有多种功能，与心血管系统疾病密切相关【2】。最近的研究表明，硫化氢对胰岛B细胞也具有显著的保护作用【3】。人体血清硫化氢主要是由肠道厌氧菌对肠腔内含硫氨基酸、硫酸盐等物质发酵而成。重症患者往往由于疾病和药物的影响，存在不同程度的菌群紊乱，继而导致硫化氢水平下降。而口服益生菌可以为人体提供丰富的有益厌氧菌，由此推测，在儿科重症患者中给予益生菌可能有助于提高血清硫化氢水平，调节胰岛素分泌，从而起到稳定血糖的作用。此外，补充益生菌还可促进厌氧有益菌分解产生更多的乙酸、丙酸和正丁酸等短链脂肪酸（SCFA），并减少D-乳酸的生成，增强肠道屏障功能，减轻炎性反应和胰岛素抵抗【4-5】，从另一方面起着稳定血糖的作用。我们以重症感染性肺炎患儿为对象，观察益生菌治疗后血糖、粪便SCFA和血浆硫化氢浓度的变化，研究益生菌在调节重症患儿糖代谢过程中的意义。
1 资料和方法
1.1 一般资料：选取2014年1月至2015年4月在我院儿童重症医学科住院的80例重症肺炎患儿，其中男46例，女34例，年龄为1～5岁。入选标准：具有肺炎的症状和体征，胸部X线征阳性，伴有气急、三凹征，不吸氧状态下血氧饱和度＜92%，或存在I型、Ⅱ型呼吸衰竭，临床证实或怀疑由感染引起【6-7】。剔除标准：①吸入、中毒、溺水和呼吸机相关性肺炎等其他非感染因素引起的肺炎者；②先天性心脏病及其他先天畸形，免疫缺陷性疾病和先天性遗传代谢性疾病的患儿；③有糖尿病史，HbA1c＞7.0%者；④使用肠外营养、禁食、应用激素和胰岛素等的患儿。记录每例入选患儿的年龄、性别、入住PICU的诊断和儿童重症评分【8】、肺损伤评分【9】等。按照信封法将80例患儿随机分为两组，一组为对照组给予常规治疗；另一组为治疗组，除常规治疗外，加用益生菌口服或鼻饲。常规治疗包括抗感染和支持对症处理，抗生素均采用三代头孢类药物，100～150mg/d，分2～3次应用。所有患儿均为按需喂养，统一的配方奶粉，每隔2～3h一次。除益生菌之外，未服用其他任何食品和药物。益生菌制剂采用双歧杆菌四联活菌口服片剂（0.5g/片），每次1片，3次/d。其中包含婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌分别不低于0.5×106CFU，蜡样芽孢杆菌不低于0.5×105CFU。本研究符合医学伦理学标准，并经医院伦理委员会批准（2015伦审第29号）。所有治疗均获得患儿家长的同意，并签署知情同意书。
1.2 标本采集与处理：①患儿于入组当天和治疗第8天每4h（从晨起8：00开始，间隔4h监测1次）采用血糖仪监测一次末梢血糖。目标血糖值为4.0～10.0mmol/L。记录监测的血糖值，计算血糖值的平均值和标准差（SDBG），将SDBG≥血糖平均值定义为高波动组，SDBG＜血糖平均值定义为低波动组【10】。②分别于入组前、治疗第8天抽取所有患儿的静脉血1ml，立即离心分离，分装置于-20℃冰箱冷藏待测。③所有患儿分别于入组前和治疗第8天留取粪便10～20g，24h内送至实验室，取50～100mg粪便样本，按照重量∶容积（g/ml）=1∶49的比例加入萃取液，充分振荡混匀后取2ml匀浆离心（10000×g）5min，取上清液-20℃冻存备用，统一检测。④记录每例患儿的临床转归。
1.3 检测方法：①肠道细菌代谢产物（乙酸、丙酸、正丁酸）的检测：按照粪便SCFA试剂盒说明，采用双抗体夹心法进行检测。②采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中硫化氢浓度。③采用Murray等【11】报道的方法测定D-乳酸水平。
1.4 统计学方法：采用STATA8.0软件进行数据统计和分析，计量资料以x±s表示，样本均数的比较采用t检验，两样本率之间的比较采用卡方检验。P≤0.05为差异有显著统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料：所有入选患儿的年龄、性别、儿童重症评分、肺损伤评分和血糖比较均无显著差异性（P＞0.05），见表1。
表1 入组时两组患儿的一般资料
2.2 血糖水平：两组患儿治疗第8天血糖水平和高波动比例均较入组当天明显下降，其中治疗组明显优于对照组，两组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.05），见表2。
表2 两组患儿治疗前后血糖水平的变化
与对照组比，*P＜0.05
2.3 粪便SCFA：治疗第8天时，治疗组患儿粪便中乙酸、丙酸和正丁酸水平均高于对照组，其中乙酸和正丁酸水平与对照组比差异有显著统计学意义（P＜0.05），见表3。
表3 两组患儿治疗前后粪便SCFA的变化（μmol/g）
与对照组比，*P＜0.05
2.4 血浆硫化氢和D-乳酸水平：入组当天时，治疗组患儿血浆硫化氢和D-乳酸水平与对照组相近。但至治疗第8天时，治疗组患儿血浆硫化氢水平较对照组明显上升，而D-乳酸含量明显下降，两组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.05），见表4。
表4 两组患儿治疗前后血浆硫化氢和D-乳酸水平的比较（x±s）
与对照组比，*P＜0.05
2.5 血糖浓度与其他指标的相关性分析：治疗第8天，治疗组患儿的血糖浓度与血浆硫化氢和乙酸水平呈显著的负相关性，而与D-乳酸水平呈显著的正相关性（P＜0.05），见表5。
表5 治疗组患儿血糖水平与其他指标的相关性
2.6 结局：两组患儿各有1例死亡，分别为ARDS和多器官功能障碍。治疗组患儿的临床治愈率为95%（38/40），对照组为80%（32/40），两者相比治疗组明显优于对照组（P=0.043）。
3 讨论
对重症患者，血糖无论是过高或过低，还是不恰当的营养疗法，都将导致患者的病死率增加，并使感染、器官功能障碍等并发症的风险上升。虽然可以通过人工监测和经验性使用胰岛素调节血糖，但在临床上却很难达到稳定血糖的目的。同时，胰岛素对血糖的调控作用具有时滞效应，即使经静脉泵入胰岛素时，胰岛素与血糖也并非呈线性对应关系。随着ICU血糖控制目标的严格化，相当一部分患者接受胰岛素治疗后出现低血糖，这更加剧了上述问题的复杂性【12】。
益生菌作为肠道菌群的有益补充，除了可调节并维护正常菌群结构和微生态环境外，并可对三大营养物质的代谢发挥不可低估的作用。已有多项研究表明，糖尿病患者肠道菌群存在不同程度的比例失衡，益生菌在调节肠道对糖的吸收、胰岛素的分泌和胰岛素受体的敏感性均有改善，而服用益生菌后对控制血糖有良好的辅助作用【13-14】。重症感染性肺炎是儿科重症中的常见病和多发病，其中血糖问题也很突出。我们发现，在重症感染性肺炎患儿中应用益生菌后，血糖波动显著降低，患儿的血糖水平得到较好地控制和稳定。这说明益生菌不仅对普通糖尿病患者，对重症患儿同样可在不影响肠道喂养的同时，通过作用于肠道对糖代谢产生重要的影响，具有优于胰岛素的不可替代的特殊效果。
硫化氢作为一种内生性生理调节剂，在心血管、神经和免疫系统中具有重要影响。近年来研究发现，硫化氢与糖代谢关系密切，尤其在糖尿病时机体循环中的硫化氢水平往往会降低，可对胰岛B细胞产生多种作用。Kaneko等【15】发现，外源性硫化氢供体L-半胱氨酸或硫氢化钠与人胰岛B细胞体外培养后，可通过增加谷胱甘肽上调硫化氢水平，抑制胰岛B细胞凋亡。此外，硫化氢还可通过调节胰岛素受体（IR）介导的信号通路，增加胰岛素的敏感性、减轻胰岛素抵抗，改善糖代谢【16】。IR是酪氨酸激酶受体，内源性硫化氢可促进胰岛素受体磷酸化，进而与磷酸肌醇-3激酶（PI3K）结合，进一步激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt），增强组织细胞对葡萄糖的摄取和利用。而通过药理学等方法补充糖尿病模型动物体内硫化氢水平可缓解糖尿病及其并发症的发生和发展，如缓解血管内皮功能障碍，保护心脏缺血-再灌注损伤以及促进糖尿病患者伤口愈合【17】。
对人体而言，内源性的硫化氢可由肠道厌氧益生菌对肠腔内含硫氨基酸、硫酸盐等物质发酵而成。此外，如双歧杆菌等厌氧菌还可分解肠道内的低聚糖等成分，产生醋酸、丙戊酸和丁酸等一些SCFA，这些物质能够调节肠道pH值，促进肠蠕动，营养结肠上皮细胞，是肠道菌群代谢产物中主要的标志物之一，并可间接地反映出肠道菌群结构的变化情况【18】。在重症感染性肺炎患儿中，由于他们年龄小，尚未建立起成熟的肠道微生态系统，再加上疾病本身和抗生素治疗的影响，使肠道菌群紊乱现象更为突出，从而严重干扰了正常硫化氢的生成。而补充益生菌后能够大大增加厌氧菌的数量，促进硫化氢的生成，维持其正常的生理水平，从而对血糖进行调节。本研究结果也显示，治疗组患儿血浆硫化氢浓度明显增加，而血糖水平显著下降，波动性减小。同时，该组患儿粪便中的乙酸和丁酸含量显著上升，血糖与血浆硫化氢浓度和粪便中的乙酸水平存在显著的正相关，提示在重症患儿中，服用益生菌后肠道菌群比例得到改善，硫化氢水平上升，其生理功能得以维持，继而控制血糖浓度。
本研究结果还显示，治疗组患儿不仅粪便中的SCFA含量明显改变，而且伴有血浆D-乳酸水平明显下降。D-乳酸作为肠道固有细菌的代谢产物，正常情况下很少被吸收，而且哺乳动物不产生D-乳酸，体内也无降解的酶系统，D-乳酸进入体内不参与代谢反应。因此，血清D-乳酸水平的上升可反映细菌或其代谢产物进入循环的量增多，并动态反映肠黏膜通透性的变化【19】。本研究结果进一步证实，服用益生菌后患儿肠道菌群结构得到改善，肠屏障功能随之好转，内毒素从肠道进入体内的数量减少，从而为疾病恢复创造了良好的内部环境，最终改善了患儿的临床结局。而一些常见的内毒素如脂多糖等，来自革兰阴性菌的细胞壁，属病原相关分子模式的一种，在体内可引发强烈的炎性反应。对重症感染性肺炎等重症患者，肠道内有害致病菌的比例上升，加之肠道屏障功能下降，必将造成脂多糖等细菌产物外漏和细菌本身移位，形成内毒素血症，继而导致胰腺发生慢性炎性反应和胰岛素抵抗【20-21】，从而引起血糖波动。
儿童重症患者与成人不同，原发性糖尿病患者所占比例极少，血糖异常除受应激反应影响外，还与胰岛素的调节密切相关【22】。所以，补充益生菌可通过调节肠道菌群，减轻肠源性炎性反应，保护胰岛B细胞功能，改善胰岛素抵抗，从根本上控制糖代谢的主要环节，维持相关多因素的平衡，而不是单纯依靠外界输注胰岛素治疗，避免血糖大幅度波动，最终使患者获益【23】。Madden等【24】研究指出，外源性益生菌虽不能在肠道内永远定植，但也足以发挥其作用，如降低肠道内pH值、改变肠道黏膜通透性、中和毒素、促进营养素的吸收代谢、调节影响肠道微生态环境的生物化学活性物质等。
参考文献
Egi M, Bellomo R, Stachowski E, et al. The interaction of chronic and acute glycemia with mortality in critically ill patients with diabetes. Crit Care Med. 2011;39(1):105-111.
Vieth SS, Rejnmark L, Mosekilde L, et al. No effect of season of birth on risk of type 1 diabetes. cancer. schizophrenia and ischemic heart disease, while some variations may be seen for pneumonia and multiple sclerosis. Dermatoendocrimol. 2013;5(2):309.
Taniguchi S, Kang L, Kimura T, et al. Hydrogen sulphide protects mouse pancreatic β-cells from cell death induced by oxidative stress, but not by endoplasmic reticulum stress. Br J Pharmacol. 2011;162(5):1171-1178.
Hussey SE, Liang H, Costford SR, et a1. TAK-242, a small-molecule inhibitor of Toll-like receptor 4 signalling, unveils similarities and differences in lipopolysaccharide- and lipid-induced inflammation and insulin resistance in muscle cells. Biosci Rep. 2013;33(1):37-47.
Vrieze A, Van Nood E, Holleman F, et a1. Transfer of intestinal microbiota from lean donors increases insulin sensitivity in individuals with metabolic syndrome. Gastroenterology. 2012;143(4):913-916.
British Thoracic Society of Standards of Care Committee. BTS guidelines for the community acquired pneumonia in childhood. Thorax. 2002;57(suppl):l-24.
胡皓夫. 重症肺炎的诊断与治疗. 实用儿科临床杂志. 2008;23(6):408-410.
李耿, 喻文亮, 于学军, 等. 小儿危重病例评分和死亡指数在急性呼吸窘迫综合征中的应用. 中华急诊医学杂志. 2007;16(5):518-521.
Zhang H. Lung function and airway reaction testing in infants and young children. J Clin Pediatr. 2010;30(8):701-703.
Hirsch IB. Glycemic variability: it's not just about A1C anymore. Diab Technol Ther. 2005;7(5):780-783.
Murray MJ, Barbose JI, Gobb CF, et al. Serum D-lactate level, as a predictor of acute intestinal ischemia in a model. J Surg Res. 1993;54(5):507-509.
江华. 危重症患者的应激性高血糖、营养治疗与血糖管理. 中华糖尿病杂志. 2015;7(2):71-72.
王红漫, 王文丽, 付朝晖, 等. 老年糖尿病患者肠道菌群的变化以及抗菌素和微生态制剂对其的影响. 重庆医科大学学报. 2009;3(8):1101-1105.
游春苹, 郭本恒, 刘振民, 等. 益生菌应用于1型糖尿病研究中的进展. 中国微生态学杂志. 2014;26(12):1463-1467.
Kaneko Y, Kimura T, Taniguchi S, et al. Glucose-induced production of hydrogen sulfide may protect the pancreatic beta-cells from apoptotic cell death by high glucose. FEBS lett. 2009;583(2):377-382.
Xue R, Hao DD, Sun JP, et al. Hydrogen sulfide treatment promotes glucose uptake by increasing insulin receptor sensitivity and ameliorates kidney lesions in type 2 diabetes. Antioxid Redox Signal. 2013;19(1):5-23.
崔红梅, 齐曦明, 高俊玲. 硫化氢在糖尿病发病机制中的探讨. 医学信息. 2014;27(3):550-551.
王玉蕾, 郑跃杰. 肠道中短链脂肪酸与过敏性疾病关系的研究进展. 中国微生态学杂志. 2013;25(1):104-108.
韦秋文, 王琳琳, 李小荣. 危重症新生儿血清二胺氧化酶和D-乳酸测定的意义. 实用儿科临床杂志. 2008;23(6):428-430.
Cani PD, Bibiloni R, Knauf C, et a1. Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat diet-induced obesity and diabetes in mice. Diabetes. 2008;57(6):1470-1481.
Angelakis E, AHnougom F, Million M, et a1. The relationship between gut microbiota and weight gain in humans. Future Microbiol. 2012;7(1):91-109.
Verhoeven JJ, den Brinker M, Hokken-Koelega AC, et al. Pathophysiological aspects of hyperglycemia in children with meningococcal sepsis and septic shock: a prospective, observational cohort study. Crit Care. 2011;15(1):44.
彭锦, 方伟强, 蔡举瑜. 非糖尿病危重症患者的血糖波动对病死率的影响. 中国急救医学. 2014;34(1):79-83.
Madden JA, Plummer SF, Tang J, et al. Effects of probiotics on preventing disruption of the intestinal microflora following antibiotic therapy: a double-blind, placebo-controlled pilot study. Int lmmunopharmacol. 2005;5(6):1091-1097.