一石二鸟，做了诊断还做预后预测！
Development and validation of a RNA binding protein-associated prognostic model for lung adenocarcinomaRNA结合蛋白相关的肺腺癌预后模型的开发和验证
一、 研究背景
RNA结合蛋白(RBP)在维持细胞的生理平衡中起着重要作用，尤其是在发育过程和应激反应期。尽管已知RBP参与多种疾病的发生和发展，但RBP在肿瘤发展中的作用仍然很少。许多报道表明RBP在肿瘤中异常表达，影响蛋白质翻译，并参与了癌变。因此，确定肺腺癌(LUAD)中差异表达的RBPs将促进我们对肺癌进展的分子机制的了解，并为诊断和预后提供潜在的生物标志物。
二、 分析流程
三、 结果解读
1.在肺腺癌(LUAD)患者中鉴定差异表达的RBPs
作者对从TCGA数据库中获取了肺腺癌数据库，包含524个肿瘤样本和59个正常肺组织样本。用Limma包分析差异RBPs，分析中总共包括1542个RBP，符合本研究筛选标准有223个RBPs（ P <0.05，| log2FC| > 1.0），其中包括101个上调的RBPs和122个下调的RBPs。
图1.肺腺癌中差异表达的RBPs，热图(A)；火山图(B)
2.差异表达的RBPs的GO和KEGG通路富集分析
用Webgestalt(http://www.webgestalt.org/)进行GO和KEGG富集分析，下调的差异表达RBPs和上调的差异表达RBPs在生物过程，细胞组成，分子功能中富集情况和参与的KEGG通路如表1所示。作者发现，在真核生物中，下调的差异RBPs主要在mRNA监控途径、RNA降解和核糖体生物发生中富集，而上调的RBPs在核糖体、剪接体和RNA降解中显著富集。
表1.异常表达RBPs的GO和KEGG通路富集分析
3.蛋白质相互作用（PPI）网络构建和关键模块选择
细胞中很多核心分子过程都是通过蛋白质分子构成的复合体完成的，所以作者使用STRING数据库对差异RBPs的蛋白相互作用进行分析，并导入Cytoscape中可视化PPI网络，包括了197个nodes和1484条edges(图2.A); 接着作者使用分子复杂检测（MCODE）插件得到关键模块和基因，并对其进行富集分析，发现了他们存在于很多重要的途径。图2.B是第一个关键模块，共107个节点，用绿色来表示下调的RBPs，红色表示上调的(图2.B)。
图2.蛋白质-蛋白质相互作用网络和模块分析
4.选择与预后相关的RBPs
上一步，作者从PPI网络中总共鉴定了197个关键的不同表达的RBP。为了找到对预后影响最大的分子，先进行了单因素Cox回归分析，获得了22个候选RBPs（图3）。接着多因素Cox回归分析了这22个预后相关的候选RBPs，确定了8个关键RBPs是LUAD患者的独立预测因子（图4，表2）。
图3.单因素Cox回归，用于识别训练集中的关键RBPs
图4.多因素Cox回归分析识别与预后相关的关键RBPs
表2.通过多因素Cox回归分析确定与预后相关的hub RBPs
5.风险评分模型的构建与分析
根据上面的表2，计算了每个患者的风险评分：Risk score= (0.1362×Exp IGF2BP1)+(1.6799×Exp IFIT1B)+(0.2843× Exp PABPC1)+(-0.2663×Exp TLR8)+(0.3882×Exp GAPDH1)+(0.8073×Exp PIWIL4)+(-0.3219× Exp RNPC3)+(0.4965×Exp ZC3H12C)
构建完风险模型后，作者进行了生存分析以评估它的预测能力。根据中位风险评分将458名LUAD患者被分为低风险和高风险组。结果表明，高风险亚组患者比低风险亚组的OS差，在KM图下还加了每个时间点的例数（图5.A）。为了进一步评估预后能力，进行了ROC分析，ROC曲线下面积（AUC）为0.775（图5.B），诊断效果中等。图5.C中绘制了风险因子关联图，显示了低风险和高风险得分人群的RBP表达和生存状态，在下图中是按照预测风险值排序的患者与生存时间之间的关系，其中，绿点代表活着的患者，红色代表过世的患者，从图中可以看出，高风险人群的死亡人数明显高于低风险人群（右边的红点更多）。
图5.TCGA队列中的八个基因预后模型的风险评分分析。低风险和高风险亚组的生存曲线(A)；ROC曲线，用于根据风险评分预测(B)；表达热图和生存状态散点图(C)。
此外，作者还评估了在其他LUAD患者队列中具有相似预后价值的八种RBPs预测模型，用GSE31210数据集作为验证队列。在GSE31210队列中，高风险评分的患者的OS也较低风险评分的患者差（图6A-6C），AUC比训练集的结果还要好。这些结果表明该预测模型具有较好的敏感性和特异性。
图6.GSE31210队列中的八个基因的预后模型的风险评分分析
6.基于八个关键RBPs的列线图的构造
基于多因素Cox分析的结果，作者利用列线图Nomogram来对回归可视化，根据每项得分计算LUAD患者的估计生存率。对每个自变量取值，在该点作一条垂直于Points轴的直线，交点即代表该自变量取值下的评分，计算每个患者各个自变量对应的points，加起来就是total points. Total Points轴上找到该患者总分对应的点，画一垂直线到生存概率轴上，交点即为该患者的1年，3年或5年生存概率。
图7. TCGA队列中用于预测LUAD患者的1、3和5年OS的列线图
此外，通过进行COX回归分析评估了TCGA中的LUAD患者不同临床特征的预后意义。结果显示，LUAD患者的肿瘤分期，原发肿瘤部位，局部淋巴结受累和危险评分与OS相关(P < 0.001)。但是，通过多元回归分析仅发现年龄，肿瘤分期和风险评分是与OS相关的独立预后因素。
表3.不同临床参数的预后价值
7.验证关键RBPs的预后价值和表达
为了进一步探讨LUAD中8个的关键RBPs预后价值，使用Kaplan Meier生存分析了其中6个RBPs，对数秩检验的结果表明，六个RBPs与LUAD患者的OS相关（图9）。
图9.Kaplan Meier验证RBPs在LUAD中的预测价值
为了进一步确定这些关键RBPs在LUAD中的表达，作者使用了人类蛋白质图谱数据库（Human Protein Atlas database http://www.proteinatlas.org/）的免疫组化结果，与正常肺组织相比，肺癌中IGF2BP1，PABPC1和GAPDH显著增加。但是，肺癌组织中TLR8，PIWIL4和ZC3H12C的抗体染色水平相对降低。此外，IFIT1B的蛋白质表达在肿瘤和正常肺组织之间没有显著差异（图10）。这一步提示读者，如果缺乏自己的临床样本，或许也可以在相应数据库中找到免疫组化的结果来验证自己的观点。
图10.使用HPA数据库验证LUAD和正常肺组织中关键RBPs的表达
小结
本篇文章中根据来自TCGA的LUAD数据，鉴定了223个在肿瘤和正常组织之间表达不同的RBPs。系统地分析了相关的生物学途径，构建了这些RBPs的共表达网络和PPI网络。此外，作者还进行了关键RBP的单变量Cox回归分析，生存分析，多因素Cox回归分析和ROC分析，以进一步探索其生物学功能和临床意义。最后基于八个与预后相关的关键RBPs基因构建了预测LUAD预后的风险模型。这些发现可能有助于开发新颖的生物标志物，用于LUAD患者的诊断和预后。