Cas9-CKI小鼠繁育路线
随着基因工程技术的发展，针对特定基因研究的小鼠模型构建也越来越成熟。但是，构建成功的模型小鼠要用于实验，还需要漫长的繁育之路要走。行百里者半九十，你以为模型构建成功了就结束了吗？NO NO NO！繁育是提供合格实验材料过程中的临门一脚。
特别是对于CKO、CKI这些组织特异性的模型小鼠，需要与cre工具鼠配繁，才能得到在特定组织敲除或敲入的目的小鼠。而基于cas9[1]技术制作的CKI小鼠，对于不同的构建策略，繁育之路也是不同的。这一点需要涉及Cas9-CKI繁育工作的研究人员注意。否则，三周怀胎，一朝分娩，含辛茹苦到断乳，最终还是宝宝心里苦。
Cas9-CKI小鼠的构建过程分体外和体内两个阶段：
1.F0 代繁育原则：
1) 利用CRISPR/Cas9系统打靶获得到的小鼠，由于Cas9系统在受精卵阶段对基因进行编辑，在F0代可能出现多种基因型并存的状态。Cas9技术制作的小鼠不带有Neo标记基因，但是会产生多条line，F0要分line繁育。
2) 阳性F0代小鼠和野生型背景鼠回交后，所得到的后代基因型将会单一。
3) F0代小鼠之间不能相互交配。
2. F1代及F1代之后繁育原则：
1) 由F0代小鼠和野生型背景鼠交配得到的后代小鼠称为F1代。
2) 阳性F1代小鼠可用于保种建系。
Cas9-CKI小鼠的模型构建主要有2个策略，虽然繁育原理不同，但是其繁育路线大致相同；下面跟大家介绍一下两个不同构建策略制作的Cas9-CKI小鼠的繁育路线。
构建策略I
使用loxp-stop-loxp系统[2]进行条件性表达靶基因时（如下图），在未删除loxp片段之前，小鼠表达野生型基因，在删除loxp片段后，小鼠表达点突变后基因。
配繁原则是配cre工具鼠，删除stop元件，构建KI小鼠或者组织特异性KI小鼠。
构建策略II
使用loxpmut-cre系统[3]进行条件性表达靶基因时（如下图），
配繁原则是CKI小鼠配cre工具鼠，野生型的loxp之间的基因首先发生倒置，使得lox2272位点变为同向，同时发生片段删除，表达预期的靶位点，所以通过配繁不同的cre工具小鼠，可以获得不同组织表达的基因的定点突变。
繁育路线一
目标得到全身插入小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠配全身性cre小鼠，得到KI/wt-creT小鼠（全身敲入目的基因且带有cre基因）；
3.KI/wt-creT小鼠配背景鼠，得到KI/wt-creW小鼠（全身敲入目的基因且不带有cre基因）；
4.KI/wt-creW小鼠互配得到KI/KI-creW小鼠。（全身敲入目的基因纯合小鼠）
繁育路线二
目标得到组织特异性插入小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠配组织特异性cre小鼠，得到fI/wt-creT小鼠（组织特异性敲入目的基因且带有cre基因）；
3.fI/wt-creT小鼠配fI/wt-creW或fI/wt小鼠，得到fI/fl-creT小鼠。（组织特异性敲入目的基因纯合小鼠）
繁育路线三
目标得到flox小鼠
1.F0（嵌合鼠）配背景鼠，得到F1代阳性鼠（F1代小鼠需测序）；选择需要的line繁育；
2.阳性F1代Fl/wt小鼠互配，得到fI/fl小鼠。（组织特异性敲入flox纯合小鼠）
Cas9-CKI小鼠繁育还是比较专业的，但是理清了思路就明白其中奥秘了。对于需要配cre工具鼠的CKI小鼠来说，如果想要得到纯合插入的小鼠，使用的cre应避免与目的基因在同一染色体上，否则得不到纯合插入小鼠。万里阳光道，不负上心人，在小鼠繁育的道路上，你多上点心知道的多一点，就更能把握正确的方向。
Cas9-CKI小鼠的鉴定。
验证F1代flox鼠打靶是否正确
01 引物设计
F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F4/R4验证插入区域。鉴定的阳性鼠继续进行Southern Blot的验证。
02 预期片段大小
条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；
条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+敲入区域；
条带3的大小为：F4/R4扩增的插入片段。
备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2kb以上，扩增难度较大。
03 电泳结果
若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3，则为阳性flox鼠；
若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。
04 测序
除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5'arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的R3）。
flox鼠的基因型鉴定
01 引物设计
交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1 kb的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。
02 预期片段大小
条带1的大小为：F5/R5扩增的5'arm端的野生型；
条带2的大小为：F6/R6扩增的5'arm端的同源臂+loxP+敲入区域；
03 电泳结果
若电泳结果只有条带1，则判断为野生鼠（+/+）；
若电泳结果只有条带2，则判断为阳性纯合鼠（flox/flox）；
若电泳结果有条带1和条带2，则为阳性杂合鼠（flox/+）。
鉴定Cre鼠删除效率
纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除效率，验证是否发生删除需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。
01 引物设计
在5'arm与3'arm上设计引物，位于cKI区域的上/下游。
02 预期片段大小
条带1的大小为：F6/R7扩增的打靶载体片段大小；
条带2的大小为：F6/R7扩增的删除后的片段大小；
条带3的大小为：F6/R6扩增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲入区域；
条带4的大小为：F5/R5扩增的5'arm端,野生型；
注：F6/R7可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出条带。
03 电泳结果
若电泳结果只有条带2，则判断为cKI纯合子（即2条染色体均发生删除）；
若电泳结果有条带2和条带4，则判断为cKI杂合子（即1条染色体发生删除）；
若电泳结果有条带1或者条带3，则可能是由于Cre删除效率低，loxp之间的区域没有发生删除。
参考文献
[1] Shalem O , Sanjana N E , Hartenian E , et al. Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014, 343(6166):84-87.
[2] Sblattero D , Lou J , Marzari R , et al. In vivo recombination as a tool to generate molecular diversity in phage antibody libraries[J]. journal of biotechnology, 2001, 74(4):303-315.
[3] Yu G , Xin-Tai Z . A New Combination of Mutated loxPs in a Vector for Construction of Phage Antibody Libraries[J]. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica(7):7.