Nature文献分享-通过外周血TCR测序预测肿瘤临床治疗效果
PD-1/PDL-1癌症免疫疗法这几年取得了飞速发展，但所涉及的机制仍然未知。了解T细胞在肿瘤免疫中的起源和命运的一个主要限制是缺乏关于癌症患者T细胞个体克隆型分布的定量信息。
选自
美国ArsenalBio公司Jane L. Grogan和美国基因泰克公司Thomas D. Wu研究组合作发现外周血T细胞扩增可预测肿瘤浸润和临床反应。2020年2月26日，《自然》杂志在线发表了这一成果。
通过对患有不同类型癌症的患者进行RNA和T细胞受体深层单细胞测序，研究人员揭示了肿瘤、正常邻近组织和外周血中各种T细胞和T细胞受体的分布。足够的证据表明不仅在肿瘤内而且在正常的相邻组织中，效应样T细胞均呈克隆型扩增。具有这种克隆型扩增基因标记的患者对抗PDL1治疗的反应最佳。值得注意的是，在外周血中还可以检测到在肿瘤和正常相邻组织中发现的这种克隆型扩增，这提供了一种方便的患者识别方法。对该数据以及其它几个外部数据集的分析表明，来自肿瘤外部新鲜的、无穷尽的替代细胞补充了肿瘤内T细胞（尤其是反应性患者），这表明这些患者的癌症免疫周期持续激活并可能与临床反应有关。
研究人员表示，尽管阻断PD 1及其配体PDL 1相互作用的抗体在癌症治疗中取得了巨大的临床成功，但其涉及的机制仍然未知。在肿瘤免疫中阐述T细胞起源和命运的主要限制因素是缺乏癌症患者中T细胞个体克隆型分布的定量信息。
摘要
尽管阻断PD 1及其配体PDL 1相互作用的抗体在癌症治疗中取得了巨大的临床成功，但其涉及的机制仍然未知。在肿瘤免疫中阐述T细胞起源和命运的主要限制因素是缺乏癌症患者中T细胞个体克隆型分布的定量信息。通过对患有不同类型癌症的患者进行RNA和T细胞受体（TCR）深层单细胞测序，研究人员揭示了肿瘤、正常邻近组织和外周血中各种T细胞和T细胞受体的分布。足够的证据表明不仅在肿瘤内而且在正常的相邻组织中，效应样T细胞均呈克隆型扩增。具有这种克隆型扩增基因标记的患者对抗PDL1治疗的反应最佳。值得注意的是，在外周血中还可以检测到在肿瘤和正常相邻组织中发现的这种克隆型扩增，这提供了一种方便的患者识别方法。对该数据以及其它几个外部数据集的分析表明，来自肿瘤外部新鲜的、无穷尽的替代细胞补充了肿瘤内T细胞（尤其是反应性患者），这表明这些患者的癌症免疫周期持续激活并可能与临床反应有关。
内容
首先，作者在14类未治疗的4种不同癌症患者中的141,623个T细胞中测序了3.3亿个mRNA转录本。并获取了每位患者的手术切除肿瘤及邻近组织（NAT）和外周血。单细胞T细胞受体（TCR）测序（scTCR-seq）在99,788个细胞中产生一个或多个α或β链的互补决定区3（CDR3）区。通过匹配CDR3区将T细胞分为56,975种不同的克隆类型，这能够测量克隆的扩增并追踪整个组织的克隆谱系。尽管患者之间很少共享个别的克隆型，但许多克隆型同时存在于患者的肿瘤和相应的NAT中。
尽管大多数克隆型是单克隆，代表了T细胞的多样性，但每名患者中9％-18％的克隆型是克隆扩增的多重体或双扩增克隆。双重扩增的克隆型占观察到的细胞的很大一部分，有时是给定隔室中大部分的T细胞。通过在NAT和肿瘤样品中的细胞计数来分析克隆，发现患者之间的克隆行为多种多样。在某些患者中，双扩增克隆沿主对角线排列，反映出两个区室中的细胞计数大致相等，并暗示肿瘤和NAT中的协调或平行过程，这是由多种相似的克隆型所引起的。相反，在其他患者中，双扩增克隆从主对角线散落，表明每个克隆在肿瘤和NAT隔室中具有独立，不同的扩展，迁移或磨损模式。
作者假设肿瘤和NAT的平行扩增可能代表T细胞从周围组织浸润，从发炎的血管中平均渗入两个组织。并从匹配的血液样本中发现了支持性证据，其中血液中高度扩增的克隆显示出肿瘤和NAT平行扩增的证据。作者发现所有克隆的外周扩增的总体量度与血液中淋巴细胞浸润的水平较高有关。值得注意的是，在具有双重扩增性强的患者中，组织中双重扩增的克隆经常会在血液中被检测到在血液中也是克隆扩增的。
Fig. 1 | Parallel dual expansion and peripheral clonal expansion.
作者进一步通过scTCR-seq数据在克隆水平进行观察。通过研究克隆，作者发现，外周扩增与肿瘤浸润之间的关系不仅适用于聚集的细胞部分，而且适用于单个克隆。该项研究结果表明外周克隆的扩增与肿瘤和NAT的平行浸润之间有着密切的关系。
于是，作者通过使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）同时测量基因表达，进一步探索了克隆扩增现象。单个T细胞的转录特征允许将相似的细胞分组为簇，本研究的特征是通过针对已发布数据集的参考基因签名交叉标记本研究的细胞并分析基因，作者发现它是特定于群集的。聚类分析确定了T效应细胞（8.1Teff），T效应记忆细胞（8.2-Tem）和调节性T细胞（4.6a-Treg，4.6b-Treg）以及常驻记忆T的亚型或生理状态（Trm）细胞，Trm的子簇分别命名为8.3a-Trm，8.3b Trm和8.3c-Trm，它们的区别在于激活耗尽标记物的低、中和高表达，包括PD1。子集8.3a至8.3c显示出与NAT相比，肿瘤的患病率增加，支持了PD1表达，终末衰竭和肿瘤微环境中同源抗原暴露增加之间的关系。
结合scTCR-seq和scRNA-seq数据可以深入了解克隆和T细胞的克隆扩增行为。然而，尽管扩增行为可归因于克隆，但簇的转录依据是单个细胞的转录谱。因此，给定的克隆可能包含具有不同转录谱并因此具有不同簇的T细胞表型的混合物。因此，本研究的数据集中的克隆表现出一系列转录多样性：一些克隆对于单个簇是同质的，而其他克隆则具有几个簇的异质细胞混合物。尽管如此，大多数克隆的主要簇都占主导地位，并作为后续分析的近似表型。正如预期的那样，克隆被分为CD8或CD4类型，表现出独特的组织扩增行为。主要的8.1、8.2和8.3 T细胞的克隆在很大程度上是双重扩增的，而CD4 T细胞的克隆通常是单克隆，对外部数据库的分析得出了相似的结果。
Fig. 2 | T cell clusters and clonal expansion
作者将原始簇映射到四个有血样的患者的克隆上，观察到许多表现出平行双重扩增的克隆是8.1-Teff克隆。为了研究这种关联，研究者根据患者的血液扩增模式和主要簇将其克隆重新分组，发现主要簇为8.1-Teff的血液扩增克隆具有显着性。此外，8.3b-Trm克隆（可能包含具有TCR独立激活的T细胞）显示出较低的平行双扩增水平。然而，8.1-Teff克隆数量更多，并且是唯一显示出血液扩增与双扩增克隆大小之间具有统计学意义的克隆。以上结果表明它们在外周克隆扩增和肿瘤浸润中起主要作用。
Extended Data Fig. 5 | T cell subsets and clonal expansion behaviour.
血液扩增的8.1-Teff克隆可能不仅在肿瘤浸润中起作用，而且在分化为其他T细胞表型中也可能起作用。尽管血液扩增的8.1-Teff克隆仅构成所有克隆的一小部分，但它们对血液和肿瘤中T细胞组成的影响不成比例。通过将单个T细胞表型与其亲本克隆的血液扩增模式联系起来，作者观察到血液和肿瘤中的8.2-Tem和8.3-Trm细胞共享的克隆型广泛存在于8.1-Teff细胞的血液扩增克隆谱系中。因此，血液扩增的8.1-Teff克隆的分化可能在血液和肿瘤中产生多种T细胞亚型。相比之下，NAT中的大多数8.2-Tem和8.3-Trm细胞属于血液非依赖性克隆，与局部扩增机制一致。
本研究的数据仅捕获跨越肿瘤、NAT和血液的克隆大小的单个快照，代表各种动态过程随时间的积累。为了了解这些动态，作者分析了基底细胞癌治疗前和治疗后T细胞的外部数据集，同时了解到两组测量值在免疫疗法效果和时间流逝上都是不同的。已有研究表明，在治疗后出现的新的克隆型不同于治疗前检测到的克隆型。作者通过将治疗后肿瘤中的新克隆与治疗前血液中现有的克隆进行匹配来扩增分析，通过大量TCR测序（TCR-seq）进行分析。
Extended Data Fig. 7 | Sharing of novel clones in tumour with clonotypes in
blood. a, Matching bulk TCR-seq and scTCR-seq clonotypes
我们发现新型CD8 细胞之间的克隆大小和转录物计数之间存在显着相关性，这表明至少有一些新的CD8 克隆是周缘起源的。此外，尽管患者在新克隆的数量和扩增方面存在实质性差异，但这些差异与外周血中克隆多样性的程度有关，进一步支持了外周与肿瘤内克隆扩增之间的关系。作者根据新的肿瘤克隆在治疗前是否与血液共享TCR序列进行了进一步分类。由于批量TCR-seq可以测量总TCR转录本，而不是具有给定TCR的细胞，因此无法区分血液扩增和非扩增克隆，但是可以通过不存在或存在匹配来区分血液独立克隆和血液相关克隆大量TCR-seq转录本。值得注意的是，在两名具有最高外周克隆多样性的患者中，我们观察到血液和衰竭表型之间的相互作用具有统计学意义：未耗尽的克隆更可能与血液相关，而耗竭的克隆与血液无关。
Fig. 3 | Peripheral clonal expansion and novel intratumoural clones.
尽管可供研究的患者有限，但该观察结果提示了两种可能的克隆扩增模式：
（1）局部独立于血液的扩增，可产生耗竭性T细胞。
（2）从当代或相对较新的血液浸润过程中，将新的、未耗尽的克隆引入肿瘤。
浸润性T细胞的流行不仅可能与肿瘤发生反应，而且还与非肿瘤抗原发生反应。作者将CDR3氨基酸序列与已知或可能对常见病毒抗原起反应的CDR3序列数据库进行了比较。尽管TCR通常匹配对应于常见病毒抗原的TCR，但几乎所有这些TCR都属于单克隆，因此没有显示出克隆扩增的证据。每个患者中的一些TCR确实表现出高水平的克隆扩增，这表明尽管“旁观者”T细胞可能在细胞水平上很普遍，但相对较少的克隆可能会对非肿瘤抗原产生反应。与分析结果呼应的是，患者的外周克隆扩增程度和导致的T细胞浸润程度各不相同，这种差异性可能解释了对免疫检查点抑制剂的不同临床反应。
总结
总之，肿瘤中的双扩增T细胞克隆及其与外周扩增克隆的分离可能代表了免疫应答的整体强度，或免疫系统针对肿瘤或外来抗原的“设定点”。本研究提出了一种广泛假定的机制的替代方案，即免疫检查点封锁作用于慢性刺激的T细胞，以逆转最初在慢性病毒感染期间观察到的终末分化或“疲惫”状态。本研究表明，从外周提供的耗竭性T细胞和T细胞克隆可能是解释患者变异性和癌症免疫疗法的临床益处的关键因素。这项研究的实际结果，通过肿瘤中双扩增克隆TCR库与外周扩增克隆的TCR库之间，观察到的相关性现象表明，可能可以通过鉴定血液中扩增的克隆来表征临床相关的瘤内T细胞的TCR组成，从而增加了液体活检的可能性。
有关免疫检查点疗法与肿瘤内T细胞耗竭之间相互作用的最新成果具有临床意义，目前很多大型制药公司研究团队目前正在评估这种意义，并涉及到更多类型的癌症。Genentech的首席科学家Thomas Wu博士领导分析PD-1治疗后从患者体内切除的肺、结肠和肾肿瘤以及邻近正常组织和外周血中的T细胞进行克隆扩增。利用scRNA-seq和T细胞受体（TCR）测序，他们在肿瘤、邻近正常组织和外周血样本中不仅发现了扩增的T细胞克隆型。最关键的是，外周血T细胞数量增加的患者对PD-1阻断疗法的反应最佳，从机制上来说，这表明免疫检查点阻断不是让肿瘤内耗竭的克隆恢复活力，而是是从肿瘤外部招募新的未耗竭克隆。这些研究表明，指出了外周血克隆扩增在预测免疫检查点阻断的临床反应上的潜在诊断价值。
Wu, T.D., Madireddi, S., de Almeida, P.E. et al. PeripheralT cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature (2020).
Author: Thomas D. Wu, Shravan Madireddi, Patricia E. de Almeida, Romain Banchereau, Ying-Jiun J. Chen, Avantika S. Chitre, Eugene Y. Chiang, Hina Iftikhar, William E. OGorman, Amelia Au-Yeung, Chikara Takahashi, Leonard D. Goldstein, Chungkee Poon, Shilpa Keerthivasan, Denise E. de Almeida Nagata, Xiangnan Du, Hyang-Mi Lee, Karl L. Banta, Sanjeev Mariathasan, Meghna Das Thakur, Mahrukh A. Huseni, Marcus Ballinger, Ivette Estay, Patrick Caplazi, Zora Modrusan, Llia Delamarre, Ira Mellman, Richard Bourgon, Jane L. Grogan
Issue&Volume: 2020-02-26
Abstract: Despite the resounding clinical success in cancer treatment of antibodies that block the interaction of PD1 with its ligand PDL11, the mechanisms involved remain unknown. A major limitation to understanding the origin and fate of T cells in tumour immunity is the lack of quantitative information on the distribution of individual clonotypes of T cells in patients with cancer. Here, by performing deep single-cell sequencing of RNA and T cell receptors in patients with different types of cancer, we survey the profiles of various populations of T cells and T cell receptors in tumours, normal adjacent tissue, and peripheral blood. We find clear evidence of clonotypic expansion of effector-like T cells not only within the tumour but also in normal adjacent tissue. Patients with gene signatures of such clonotypic expansion respond best to anti-PDL1 therapy. Notably, expanded clonotypes found in the tumour and normal adjacent tissue can also typically be detected in peripheral blood, which suggests a convenient approach to patient identification. Analyses of our data together with several external datasets suggest that intratumoural T cells, especially in responsive patients, are replenished with fresh, non-exhausted replacement cells from sites outside the tumour, suggesting continued activity of the cancer immunity cycle in these patients, the acceleration of which may be associated with clinical response.
DOI: 10.1038/s41586-020-2056-8
Source: https://www.nature.com/articles/s41586-020-2056-8
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