什么？miRNA→明星通路→肿瘤，还能发到中科院二区！
今天介绍的文献来自温州医学院的题为“MiRNA-516a promotes bladder cancer metastasis by inhibiting MMP9 protein degradation via the AKT/FOXO3A/SMURF1 axis”的文章，此文发表在了Clin Transl Med （中科院2区）即miRNA-516a通过抑制AKT / FOXO3A / SMURF1轴的MMP9蛋白降解来促进膀胱癌转移。
癌症转移是导致膀胱癌患者死亡的主要原因。然而，现在的治疗方法对膀胱癌的转移抑制效果甚微。传统的分级和分期识别对识别转移性膀胱癌的作用有限。越来越多的证据表明，microRNA的异常表达与癌症发展进程密切相关。许多的miRNA已经被确定为癌症诊断指标及治疗的分子靶点。该研究揭示了miR-516a在促进BC转移中的关键功能并且阐明了其中的分子机制，miR-516a可能是一个潜在的BC诊断和治疗的靶点。
作者发现miR-516a在人类侵袭性BC组织明显高于非侵袭性BC组织。使用TCGA数据库发现BC患者的miR-516a的表达与转移都有所增加。相较于没有淋巴结转移的患者组织，有淋巴转移的患者组织的miR-516a表达量也是增加的。由于T24细胞系转移能力有限，另外一个衍生的细胞系T24T具有明显的转移能力。作者对这两个细胞系进行测量，发现miR-516a在T24T显著高于T24，符合miR-516a与BC迁移和侵袭的关系。作者进一步利用针对miR-516a的海绵体抑制剂转染到T24T细胞系，并且通过实时PCR检测转染效率。在UMUC3和J82细胞系可以发现miR-516a被稳定抑制。体外transwell实验发现抑制miR-516a后细胞的迁移和侵袭都明显受到抑制。接下来，T24T（转染了空载体）和T24T（转感染了抗miR-516a）的细胞分别通过尾静脉或脾脏注射到裸鼠体内，以评估其转移能力。与体外研究一致，抑制miR-516a后，裸鼠肺转移的程度明显降低。这些发现表明miR-516a促进人类BC细胞的转移。
作者前期研究表明，在UMUC3和J82细胞系中，miR-516a可以结合PHLPP2的3'UTR。为了确定PHLPP2是否介导miR-516a的转移作用，PHLPP2沉默的T24T（anti-miR-516a）细胞以及UMUC3（anti-miR-516a）细胞被用于进一步的功能分析。结果显示PHLPP2的沉默促进了T24T（anti-miR-516a）和UMUC3（anti-miR-516a）细胞的迁移和侵袭。说明PHLPP2 的抑制促进了 miR-516a 介导的 BC 细胞迁移和侵袭。
前期研究表明自噬和BC细胞生长受到miR-516a的调控。作者构建anti-miR-516a的T24T转染细胞和UMUC3细胞，并且利用自噬抑制剂BAF处理，结果发现BAF处理后anti-miR-516a转染的T24T和UMUC3细胞侵袭性不受影响，而空载则受到明显抑制，说明miR-516a依赖于自噬途径促进细胞侵袭。
为了进一步探索miR-516a影响下游基因的BC转移机制，作者对转染空载和anti-miR-516a的T24T及UMUC3细胞western发现，在anti-miR-516a细胞中MMP9蛋白表达明显下调。过表达MMP9，transwell实验表明细胞的迁移和侵袭能力明显增加。在T24T和UMUC3细胞降低PHLPP2（shPHLPP2）发现MMP9蛋白量增加。表明MMP9在miR-516a的下游并且发挥促进癌细胞转移和侵袭的作用。
前期结果表明，在T24T和UMUC3细胞中抑制miR-516a后，MMP9蛋白表达量持续降低。在anti-miR-516a的T24T细胞中，MMP9 mRNA的表达被上调，而在anti-miR-516a的UMUC3细胞中，它被降低。这些结果表明，miR-516a/PHLPP2途径调节了MMP9在非mRNA水平上的表达。作者进一步评估了miR-516a对MMP9蛋白降解的影响。CHX是一种蛋白质合成抑制剂, 它能干扰蛋白质合成过程中的转位并阻碍翻译。在特定的时间加入CHX揭示了miR-516a对MMP9降解的动态变化的影响。miR-516a的过表达可以显著降低MMP9蛋白的降解率，说明miR-516a减少了MMP9的降解。与 T24T（anti-miR-516a/sh control）细胞相比，T24T（anti-miR-516a/sh PHLPP2 #2 和 #5）细胞中的 MMP9 降解率降低，但在T24T（anti-miR-516a/sh control）中恢复到正常。作者又用MG-132处理细胞看MMP9的降解是否依赖蛋白酶体。与未处理的对照组相比，MG-132处理的细胞出现了明显的MMP9蛋白积累。在T24T/UMUC3（anti-miR-516a）细胞MG-132处理后积累了大量的MMP9。这些结果说明miR-516a通过蛋白酶体依赖的方式抑制了MMP9蛋白的降解。
作者首先使用 UbiBrower 数据库筛选了一系列候选物，然后对 MMP9 进行免疫沉淀并进行质谱分析以确定哪种 E3 泛素连接酶在 MMP9 降解的 miR-516a 调节中起作用。UbiBrowser 预测和质谱结果表明 HSPA8、CBL 和 SMURF1 三种酶可能参与 miR-516a 对 MMP9 降解的调节。在 T24T（空载体）和 T24T（anti- miR-516a）细胞中评估了这三种蛋白质的表达，只有 SMURF1 的表达在 T24T（anti- miR-516a）细胞中显着上调，而其他蛋白质的表达没有变化。与此一致，在相同实验条件下，SMURF1 在 T24T（anti- miR-516a/shPHLPP2 #2 & #5）细胞中的表达比在相应的对照中低得多，表明 SMURF1 可能参与 MMP9 的降解调节。此外，免疫共沉淀证实了SMURF1-MMP9 相互作用。
在T24T（anti-miR-516a）细胞中的SMURF1 mRNA水平明显高于T24T（空载体）细胞。在T24T（anti-miR-516a）细胞中抑制PHLPP2降低了SMURF1 mRNA水平。这些结果表明，miR-516a对SMURF1表达的调节可能发生在转录阶段。荧光素酶报告试验显示，miR-516a的抑制作用导致SMURF1驱动的启动子活性增加约2.8倍。而在T24T（anti-miR-516a）细胞中敲除PHLPP2则恢复了SMURF1启动子的活性。作者对启动子分析显示几个潜在的转录因子包括OXO3A、FOXP3、RELA、ETS-1和SP1可能调控SMURF1转录水平。通过蛋白质印迹以检测这些转录因子在 T24T（空载体）和 T24T（anti- miR-516a）细胞中的表达。只有p-FOXO3A S253和SIX2被明显下调，而FOXO3A、FOXP3、NF-κB（RELA）、ETS-1和SP1的水平没有变化，表明p-FOXO3A S253和SIX2可能参与了miR-516a介导的对SMURF1的转录。因为 SIX2 可以在基因转录水平上调 SMURF1 表达，这与作者的结果相反，SIX2 被排除在 miR-516a 介导的 SMURF1 表达调节中作为候选转录因子。尽管miR-516a抑制后FOO3A蛋白水平没有变化，但p-FOX3A Ser253蛋白表达明显减少。这一结果意味着非磷酸化的FOXO3A的表达被上调。AKT是一种重要的直接使FOXO3A磷酸化的重要酶。AKT的Ser253磷酸化可以调节FOXO3A的核/胞质穿梭。在T24T（空载体）和T24T（anti-miR-516a/shPHLPP2#2）中，FOXO3A和AKT的磷酸化都有所增加，这样的结果验证了作者的假设，即miR-516a-PHLLP2调节SMURF1的转录。为了进一步弄清AKT-FOXO3A途径在miR-516a诱导的促进BC细胞迁移和侵袭中的作用，作者使用AKT激活剂胰岛素类生长因子-1（IGF-1）来处理T24T anti-miR-516a细胞，并发现IGF-1处理可以显著逆转miR-516a对AKT-FOXO3A通路的抑制作用。在对71对临床样本分析发现，PHLPP2和SMURF1的表达明显与miR-516a的表达呈负相关。总的来说miR-516a可以通过激活AKT-FOXO3A途径促进BC细胞迁移和侵袭。