王健君：实证百年科学猜想，人体冻存未来可期

王健君：中国科学院化学研究所  研究员

一百年前科学家“水变成冰要经过冰核”这个中间态的预言一直不能得到证实，他的团队攻克了这个百年的难题，并通过研究发现低温动物的抗冻蛋白控制冰晶生长的控冰机制。这一基础科学问题的突破，为食品、航空、医疗、生物等领域的应用提供了科学支持。当冰冻过程可控，作为超越人类极限的人体冻存技术或许可以期待。

大家可能知道冷冻保存，因为每家每户都有冰箱，冰箱就有冷冻保存的功能。但是大家可能也会很好奇，为什么这几年冷冻保存这么受关注,甚至有争议？

比如说关于卵母细胞的冻存，提出了完全不同的议案，有些人支持卵母细胞的冻存，而另外一些代表则完全反对卵母细胞的冻存；

2016年英国法院判决一个患有绝症的14岁女孩的母亲胜诉，允许这位母亲在其女儿死后将其冻存。这个判决当时引起了全世界的轰动，因为即使在今年科学界、法律界还有伦理等方面，对人体冻存都存在着争议。

我们可以看一下冷冻保存的定义，就可以明白为什么冻存这么受关注，甚至有争议。

冷冻保存就是将冷冻保存对象,如细胞、组织、器官等置于超低温的环境当中，一般是指在零下196℃的液氮环境当中，使其新陈代谢大大降低，待恢复正常的生理温度以后，这些冻存对象，细胞、组织、器官能恢复它正常的生理功能。如果将冻存对象换成人体，那就意味着几十年以后，或者几千年以后，这个人体如果能复苏的话，就能实现永生了。

这是历代的帝王、古代埃及的法老一直追求的梦想。所以大家可能能明白为什么冻存这几年这么受关注，甚至有争议。

世界上真正的第一例冻存的人体叫James bedford，他在其死后接受了冷冻保存，距今已经有五十三年了。目前世界上总共有受冻存的人体约300例，其中包括两个中国人。

现在我可以很肯定的告诉大家，所有这些冻存的人，由于技术的原因，他们是不可能复苏的。

所以也有科学家认为将人体的冷冻保存是伪科学。但是美国的一个期刊《生活科学》，它是专门报道重大的科学突破和预测未来研究方向的一个杂志，它将人体冻存技术评为：十大超越人体极限的未来科学技术之一。

研究发现环境的温度降低的时候，能大大增加器官保存时间。比如说目前的器官的保存温度是在零上4℃，它保存的时间是几个小时，长的可以达到二十来个小时。

理论研究发现，如果将器官置于零下140℃的时候，可以长期的保持。事实上，目前有些细胞，将其置于零下196℃的液氮环境当中的时候，可以实现长期的冻存。可是很遗憾的是，目前还没有冻存器官的技术。所以导致保存器官的时间很短，几个小时、长的二十来个小时，导致了大量的器官被废弃。

研究数据显示大约70%左右的，或者超过70%的心肺，由于短时间内不能找到受体而被废弃，这是非常遗憾的。因为即使在器官移植非常发达的美国，在七十个器官衰竭需要移植的人中，只有一个才能得到器官的移植。

所以在1970年，实施人类肝脏移植手术的，被称为“器官移植之父”的Thomas Starzl就预言：“只有当保存器官的技术得到突破，使器官得以保存数周、甚至数月的时候，器官移植才有可能大范围的推广。”

但很遗憾，他这个说法已经五十年过去了，现在的器官保存技术并没有很大的进步。

除了保存器官，冷冻保存还有其他很大范围的领域，比如说能挽救新冠危重患者生命的细胞疗法，当然这个细胞疗法也能治帕金森病，它的大范围的推广,必须依赖于干细胞的安全的冷冻保存；当然另外辅助生殖领域的生殖细胞的冻存，它的安全性和可靠性，也是非常关键的，因为这涉及到我们的下一代。

大家会问，为什么五十年来冻存技术没有得到突破的进展，或者它的关键的科学问题是什么呢？

其实冷冻保存有三要素：第一，当然是冻存对象：细胞、组织、器官；大家知道器官里面有超过70%的是水分，将这些水分置于零下的时候，它必然会结冰，所以这就涉及到冻存的第二要素，这些冰如果不控制的话,它必然会伤害细胞器官。

这是一组光学显微镜图片，可以看到卵母细胞在冰冻前后受到了冰晶的损害；冻存第三个要素就是要添加冷冻保护剂，使器官细胞内避免大冰晶的产生，使器官受到保护，免受冰冻的伤害。

目前大量使用的冻存保护剂是一种与盐相似的，一种跟水能发生强作用的分子。它的加入可以使器官内部在低温下面不结冰。但是要使器官内将近70%的水分，在零下140℃下面不结冰，那必须添加大量的这种有毒的盐。

有美国的科学家理论分析发现，当盐的重量比达到50—60%的时候，器官内可以实现不结冰，但是我刚才说了，这么高浓度的盐,必然对细胞有损害。

比如说目前普遍使用的冻存剂的一种，也是另外一种盐的分子，当它的浓度超过2%的时候，它会损害细胞，当然严重的时候，会改变它的一些基因。

由于这个原因，所以世界上很多的科学家都努力尝试着降低有毒的盐分子的使用。

一个方法就是可以快速地降低温度，然后升高温度。在水还没反应过来变成冰之前，已经达到了预期温度。但这个方法对细胞是适用的，因为细胞体积小、结构简单，但是对器官是不适用的，因为器官体积大、复杂。

这样快速降温、升温的时候，必然导致有个温度梯度的存在，就意味着在器官里面，有些地方温度高，有些地方温度低，当然都是零下的。相对比较温度高的地方，必然会形成大冰晶损害器官。这也是目前能冻存细胞，但是不能冻存器官的一个原因。

大家肯定会问，能不能有其他的冻存的方法避免这种有毒的盐的使用？

其实自然界确实有一些生物，它可以在酷寒下生存。比如说生活于沙漠地区的甲虫，叫小胸鳖甲；生活于极地的这种雪虱；还有生活于我国东北地区的冬尺蠖；还有阿拉斯加林蛙等等。

我2013年12月去新疆采集这种虫子，叫小胸鳖甲。当时气温是零下30℃左右，当我们把雪移开，这个虫子就跟土壤搭在一块，就像冻成一块的。但是很有意思的事情，我把虫子放在我手上几分钟以后，虫子能爬起来。这确实是非常神奇。

大家可能也会问，这些虫子体内不可能含有大量的有毒的盐。如果有的话，它没被冻死可能也被毒死了,对吧？

所以对自然界控冰体系的、生物体系的研究，必然会为我们冷冻保存提供新的思路。

确实也有很多科学家研究为什么这些虫子能在低温下生存？他们发现虫子体内主要存在的两类蛋白能控制冰晶的形成：一类叫抗冻蛋白，它能控制冰晶的生长；另一类叫冰晶核蛋白，它能控制冰晶的成核。

我得说一下冰晶的形成可以分成两步：一步是成核，一步是生长。

成核最初是一百多年前美国的科学家吉布斯提出来的。他通过简单的宏观的能量分析，提出冰晶的形成必然会经过一个形成临界冰核的阶段。如果临界冰核没有形成的话，冰晶不可能生成。

经典成核理论提出已经一百多年了,但提出的时候, 这么多年一直有争议，有些人支持这个经典成核理论，有些人则反对经典成核理论。

关键就是目前实验上没有探测到临界冰核的存在。

有三个难点：一个就是临界冰核尺寸小。尺寸小到什么地步呢？是纳米级别,相当于我们头发丝的几万分之一；另外一个临界冰核存在的时间窗口很短，瞬间的，是纳秒级别，非常快；另外一个它是随机发生的，随机意味着什么？它不可预测，没有规律。

由于以上三个难点，世界上最先进的仪器，没法捕捉到临界冰核，导致了经典成核理论是否适用于冰晶的形成，一直存在着争议。

我们根据自然界当中存在着两类蛋白，一类就是冰晶核蛋白，是目前世界上最好的冰晶成核剂；另一类是抗冻蛋白，它没有明显的促进冰核形成的效果。更有意思的事情，这两类蛋白唯一的区别就是尺寸不一样。抗冻蛋白纳米级别，冰晶核蛋白是几十纳米，两者差一个数量级。

为什么尺寸对冰核的形成如此重要？换句话说，是不是可以制备一系列的不同尺寸的这类蛋白，让它去探索这个临界冰核，是不是可以把临界冰核捕捉住？

事实上，我们通过生物工程的方法制备了一系列的蛋白，但是遗憾的是，这类蛋白大到十几纳米的时候，机械性能不好，它会产生弯曲，所以这种蛋白材料，不可能用来单变量的研究尺寸的影响，所以我们继续找，找到另一种材料叫氧化石墨烯。

氧化石墨烯就是很薄的一层片层，并且它的机械性能非常好。我们可以制备一系列尺寸氧化石墨烯。这是氧化石墨烯的电子显微镜图片，可以从3纳米、8纳米、11纳米、21纳米、50纳米等等。我们就可以用这些纳米颗粒去模拟蛋白，去研究尺寸对冰晶成核的影响。

确实实验发现氧化石墨烯纳米颗粒的尺寸，与冰晶成核过冷度的乘积是一个固定值，并且这个固定值具有普适性。它对氧化石墨烯的状态，无论是分散在水里面的，还是固定在表面的不同颗粒都适用。

这么一个普适的物理现象，必然后面有一个理论机制。

当然我们通过理论分析发现，其实氧化石墨烯上临界冰核的形成过程，与我们往杯子里面倒水的这个过程相类似。当我们往杯子里面倒水的时候，水平面与杯沿齐平的时候，水不会溢出来。我们继续倒水，水会鼓出来，这时候表面张力会把水包住。继续倒水，鼓到一定临界程度的时候，水会忽然溢出来。

临界冰核也是这种情况，它会在氧化石墨烯上形成，迅速涨到纳米颗粒的边缘。这时候由于在表面张力作用下，它不会形成冰晶，只有它继续鼓，鼓到一定程度，它会忽然瞬间的形成冰晶。进一步理论分析发现，当氧化石墨烯的颗粒，与临界冰核的尺寸相当的时候，冰晶才有可能形成。

那就意味着，我们可以用纳米颗粒，做一把尺子去量临界冰核，从而我们就证实了一百多年前吉布斯等人预测的临界冰核的存在。

接下来我们继续讲讲这个能控制冰晶生长的抗冻蛋白的控冰机制。

这是2013年我去新疆采集样品的现场照片，可以看到虫子就在雪和土壤之间。这个虫子能在酷寒下生存的重要原因之一，就是体内存在抗冻蛋白。

抗冻蛋白有两个面,就像我们手机一样，当然尺寸是纳米级别的。

最初是一个美国科学家发现了这种抗冻蛋白，所以很多科学家研究了抗冻蛋白的抗冻冰机制。但是五十多年来，关于抗冻蛋白它是喜欢冰或者不喜欢冰，一直存在争议。

我是2010年开始做这个研究的。我发现所有这些研究，它没有明确到底哪一个面喜欢冰，或者哪一个面不喜欢冰？我就想，我能不能把纳米尺度的抗冻蛋白定向固定住，然后选择性研究抗冻蛋白每一个面的亲冰或者亲水性能。

这个想法当然算不错了，示意图画的很简单，但实验操作上是非常困难的。

我的两个博士生去做这个事情，最后有个叫刘凯的硕博生，克服了两个困难，一个要把是纳米级别的，用手机定向固定是非常难的；另外一个，我定向固定还不够，还要维持蛋白的活性，花了可能六年的时间，他做到了。发现蛋白有两个面，每个面的亲冰、亲水不一样，一面亲冰，一面亲水。

为什么之前有这个争议？相当于我们有个“盲人摸象”的故事一样。

我们通过定向固定，选择性研究抗冻蛋白的性能，解决了这个争议。

解决这个争议以后，对我们理解抗冻蛋白的控冰机制有什么帮助呢？

大家看一下这个示意图：蛋白它一面亲冰，可以跟冰很好的结合；一面亲水，可以跟水很好的结合。这样就在冰水界面形成很薄的一层蛋白层面，或者分子层面的一堵墙，阻碍了水变成冰，这就是一个抗冻蛋白的控冰机制。

通过我们对自然界控冰体系的研究，我们可以看出，自然界它不是用简单地加大量的盐去保护自己，而是通过控制冰的成核，控制冰的生长。

我们算有所发现，在有所发现以后，我们也做到了有所创造，这是我们做材料的一个特色。

我们制备了一些能控制冰晶形成的冷冻保护材料。比如我们目前辅助生殖技术里面，要用大量的冻存液冻存生殖细胞，精子、卵子、还有受精卵等等。目前这些冻存液都来源于外国进口，更严重的是，这些冻存液用的是传统的方法，含有一些二甲基亚砜，刚才我说了它有毒的。用我们的这个分子冻存卵母细胞以后，它复苏率优于目前市场上二甲基亚砜含量15%的，细胞的复苏率远优于进口的二甲基亚砜含量为零的复苏率。

目前我们在东莞松山湖材料实验室的支持下，严格按照国家的标准，正在生产这些冻存试剂。当然我们也研制了一系列能用于干细胞冻存的冻存液。

比如我们用于脐带间充质干细胞冻存的材料。用我们这个材料冻存干细胞以后，它的复苏率达到了92%，优于或者远优于市场上有毒的二甲基亚砜含量为10%的冻存液。

目前我们与北医三院的眼科合作，我们希望通过我们创制的一些新的控冰材料，通过从冻存简单的组织器官入手，比如说眼角膜的冻存。

希望通过我们材料的创新，使冻存技术得到进步，当然是突破性的进步，让许多医疗技术能充分发挥它们挽救生命的能力。

这是我的一个德国合作者，他2018年去南极捕鱼，提取鱼内的抗冻蛋白。

大家知道前段时间有报道，我们一般的老百姓可以到空间站去待几天，当然这是距离比较短的。

我们知道宇宙很广袤，如果想要旅行的话，可能会花几十年算少的。我们从地球到那个地方，如果没有采取措施的话，可能生命已经结束了。

我们希望与世界上不同领域的科学家合作，使冷冻保存助力我们以后的星际旅行。