5+乳腺癌表观遗传深度剖析 / 开普饭

Methylome and transcriptome analyses reveal insights into the epigenetic basis for the good survival of hypomethylated ER-positive breast cancer subtype甲基化组和转录组分析揭示了低甲基化、雌激素受体阳性乳腺癌亚型良好生存的表观遗传学基础

一.研究背景

乳腺癌（BRCA）根据不同的分子特征分为不同的亚型。激素受体状态是BRCA最重要的特征之一，约70%的BRCA患者是ER（雌激素受体）阳性。

ER阳性的BRCA也包括两大亚型，即管腔A型和管腔B型，管腔B型肿瘤的预后较管腔A亚型差。据研究表明，表观遗传修饰，尤其是DNA甲基化，在BRCA进展中发挥重要作用，并与BRCA异质性密切相关。

二.分析流程

三.结果解读

1.TCGA-BRCA的一致性聚类和亚群的甲基化水平

作者收集了TCGA数据库中785个BRCA和98个正常乳腺组织样本，分析和筛选了甲基化数据(共485,577个CpG位点)。在883个样本中去除了甲基化β值丢失的CpG位点，有363,870个CpG位点保留。然后作者设定一个肿瘤甲基化的阈值，并提取18,870个CpG位点用于后续分析。

使用R包‘consusclustERplus’ 作了一致性聚类：

将聚类阈值设为K=6时，确定了两个主要的亚群，它们包含了所有癌症样本的90.0%，其中415个样本位于亚群1；292个样本位于亚群2(图1a)。
然后利用严格的阈值K=20，发现两个亚群中的大多数样本保持稳定，分别在亚群1和亚群2中保留了337(81.2%，337/415)和259(88.7%，259/292)样本(图1b)。
此外，还计算了亚群1、亚群2和正常样本中CpG位点的平均甲基化水平：与正常样本相比，亚群1的甲基化水平最高，亚群2的甲基化水平中等(图1c)。
热图还显示，在TGCA-BRCA亚群1、2之间存在明显不同的甲基化特征(图1d)。

图1.基于DNA甲基化的BRCA样品聚类

2.低甲基化ER阳性TCGA-BRCA亚群具有良好的OS

作者在亚群1、2的TCGA-BRCA样本中研究了组织类型。结果表明，这两个簇具有相似的组织学组成比（例如浸润性导管癌和浸润性小叶癌)(图2a)；
此外，还进行了生存分析，以探索在亚群1和2中TCGA-BRCA的总体生存概率，两组患者的生存期无显著差异(p= 0.30)(图2b)；
由于激素受体状态，特别是ER与肿瘤进展和甲基化修饰密切相管，作者，探讨了ER在亚群1和亚群2中的状态。结果显示，大部分亚群1样品为ER阳性BRCA；而亚群2则较复杂：其中43.2%(112/259)的ER阳性BRCA, 52.1%(135/ 259)的ER阴性BRCA(图2c）；
根据激素受体状态和甲基化概况，作者将肿瘤分为三个亚组：高甲基化ER阳性、低甲基化ER阳性和低甲基化ER阴性BRCA，作了生存分析：发现低甲基化阳性组的生存期优于高甲基化ER阳性和低甲基化ER阴性组（图2d）。

图2.BRCA样本亚群的临床特征

3.低甲基化ER阳性具有良好OS的发现在另一个独立群体中得到验证

作者收集并分析了另一个包含30个ER阳性样本的甲基化数据集，同样，一致性聚类分析仍将肿瘤样本分为了两大聚类(图3a)，并通过热图进行了证实(图3b)。进一步的分析表明，低甲基化的ER阳性BRCA亚群确实具有较好的OS(图3c, d)。

图3.BRCA在独立群体中的一致性聚类分析

4.在低甲基化ER阳性和高甲基化ER阳性TCGA-BRCA亚型之间存在大量甲基化差异的CpG位点

由于ER阳性的TCGA-BRCA有两个甲基化亚群，在OS上存在显著差异，作者重点关注了那些有助于ER阳性BRCA分类的CpG位点。

在高甲基化ER阳性和低甲基化ER阳性两个亚群中确定了3032个DMCs（差异甲基化CpG位点）。在这些DMCs中，低甲基化ER阳性亚组中约有91.4%(2772/3032)的图4a)。
然后作者把上述这2772个低甲基DMCs按甲基化平均得分分为两个亚组。通过生存分析进一步发现，低甲基化水平的ER阳性肿瘤样本具有良好的OS(图4b）。
又作了基因注释分析，低甲基化DMCs主要位于“Body”、“TSS200”等基因组序列中。
还作了GSEA，结果显示:与DMCs相关的1190个基因在Wnt (hsa04310)、Hippo (has04309)、Rap1 (hsa04015)、基底细胞癌(hsa05217)、乳腺癌(hsa05202))等通路中显著富集(图4d)。这表明这些低甲基化DMCs在抑制ER阳性BRCA进展中的潜在作用。

图4.两个ER阳性BRCA亚群之间存在甲基化差异的CpG位点

5.ER阳性BRCA亚群中关键的低甲基化DMCs对肿瘤有抑制作用

为了检测这些低甲基化DMCs是否有可能具有促进肿瘤抑制作用的基因转录的作用，作者共鉴定了178个基因，基因的表达与低甲基化DMCs的低甲基化与基因表达水平升高有关(图5a)。
进一步的蛋白质-蛋白质相互作用分析表明，蛋白之间的相互作用明显多于预期。(图5b)。

图5.在ER阳性BRCA中，甲基化水平与基因表达有关

6.ER阳性BRCA的低甲基化促进肿瘤抑制基因的表达

作者继续在ER阳性TGCA-BRCA中鉴定出47(47/178)个高表达、OS好的基因(图6a）。
作KEGG通路分析：这47个基因在Wnt信号通路、NF-kappa B信号通路、以及癌症中的转录失调等通路中均有富集（图6b）。
作者从其他基因相关功能的文献中发现部分低甲基化DMCs通过调节基因转录来抑制肿瘤。

比如cg24319902是位于SFRP1 TSS200区域的CpG位点，与高甲基化ER阳性的TGCA-BRCA相比，低甲基化阳性的TGCA-BRCA CpG位点的甲基化水平降低(图6c)。且cg24319902甲基化与SFRP1的表达水平呈负相关(图6d）。在TCGA-BRCA中，较高的SFRP1表达水平具有更好的OS(图6e)。
此外，另一个CpG位点，cg21383810在低甲基化ER阳性的TGCA-BRCA亚群中也呈现低甲基化(图6f)。该CpG位点位于WTF1的TSS1500区域，同样与WIFI的表达呈负相关(图6g）。较高的WTF1表达水平具有更好的OS(图6h）。

图6.ER阳性BRCA低甲基化促进肿瘤抑制基因的表达

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