只做PD-1看着很单调无亮点，9 期刊：加点m6A试试！

免疫治疗正成为人类抗癌治疗史中前所未有的核武器，而免疫哨点抑制剂就是其中发挥作用的核弹头。
作为免疫哨点抑制剂的先锋代表，程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）抑制剂已在诸如非小细胞肺癌和黑色素瘤等高突变负荷肿瘤的治疗中取得了巨大的成功。
尽管抗PD-1治疗在非小细胞肺癌的治疗中是屡建奇功，但在满是低突变负荷的结直肠癌的治疗中，却是被窝里打拳，有劲儿使不上。
然而，最近有项研究表明可以通过抑制m6A甲基转移酶——METTL3/14把这个“被子”掀起来，大大增强抗PD-1治疗在结直肠癌中的疗效，你说这篇文章要不要看？！
2020 年 9 月 23 日，加州大学圣地亚哥分校（USCD）Rana教授团队在EMBO J (2019 IF=9.889)上在线发表了题为 m6A RNA methyltransferases METTL3/14 regulate immune responses to anti‐PD‐1 therapy的研究成果。
PMID: 32964498

题目解读

初读题目，应用解螺旋经典「体系课程」里讲的方法论进行要素拆解：

疾病：未知
表型：抗PD-1治疗的免疫应答
主变量：m6A甲基转移酶——Mettl3、Mettl14
猜测这篇文章主要解决以下两个问题：
问题一：Mettl3/14与抗PD-1的免疫应答是否有关系？
问题二：Mettl3/14与抗PD-1的免疫应答是如何发生关系的？

假设逻辑

继续阅读摘要,提取关键信息,进行要素补充
构建完整要素：
疾病：结直肠癌（pMMR-MSI-L CRC）、黑色素瘤
表型：抗PD-1治疗的免疫应答
主变量：m6A甲基转移酶——Mettl3、Mettl14
交互变量：Ythdf2（m6A阅读蛋白）
效应变量：CD8+ T细胞、IFN-γ（干扰素-γ）、Stat1（信号转导与转录激活因子 1）mRNA 、Irf1（干扰素调节因子-1） mRNA
通路：IFN-γ-Stat1-Irf1
提出假设：结直肠癌中，敲除Mettl3/14可通过Ythdf2稳定Stat1和Irf1 mRNA，促进IFN-γ-Stat1-Irf1信号通路，进而增强结直肠癌抗PD-1治疗中的免疫应答。

数据泛读

问题一：敲除Mettl3/14是否增强CRC抗PD-1治疗的免疫应答？
Tips：增强免疫应答即增强治疗效果，也即表现为抑制肿瘤大小、延长寿命等

Fig.1 Depletion of Mettl3 or Mettl14 sensitizes CT26 and B16 tumors to immunotherapy.


A-B图，WB验证sgRNA在两个肿瘤细胞系CT26（小鼠结直肠癌）和B16（小鼠黑色素瘤）中的敲除效果。
C-D图，Mettl3/Mettl4敲除的CT26和B16肿瘤生长显著受抑。
E-F图，Mettl3/Mettl4敲除的CT26和B16肿瘤移植小鼠生存期显著延长。
总结：Fig.1提示Mettl3或Mettl14的缺失使结直肠癌和黑色素瘤对抗PD-1治疗变敏感。

问题二：增强免疫应答涉及哪些免疫细胞和细胞因子？
Tips：免疫应答主要涉及免疫细胞和细胞因子，因此通过检测免疫细胞和细胞因子去探索机制，就需要FACS（流式细胞荧光分选技术）和ELISA（酶联免疫吸附测定）！这里需要对免疫相关的基础实验技术有点基本了解哦！
Fig.2 Mettl3 or Mettl14 deficiency enhances tumor-infiltrating CD8+ T cells and cytokine production.

A图，对CT26肿瘤组织FACS，Mettl3/Mettl14缺失后CD8+T细胞胞免疫浸润显著增加。
B图，免疫组化染色进行镜下视觉验证CD8+T细胞免疫浸润。
C图，Mettl3/Mettl14缺失后包含颗粒酶B的CD8+T细胞比例显著增加。
D-E图，CD8+T细胞是控制肿瘤生长的关键。
F-G图，Mettl3/Mettl14缺失后，CT26瘤内IFN-γ显著增加。
总结：Fig.2提示Mettl3或Mettl14缺失通过调节肿瘤微环境中细胞因子和趋化因子的产生增强了免疫治疗的效果。
接下来是不是不知道该怎么做了？继续深挖！前两个问题的解决只到细胞、蛋白水平，还未涉及诸如mRNA分子水平（国自然热点研究方向）的机制变化。
问题三：Mettl3/14的分子靶点是什么？
Tips：此时需要高分文章利器——高端大气上档次的RNA测序（RNA-seq）和甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-Seq）等技术！

Fig.3 Identification of target genes of Mettl3 and Mettl14 by RNA-seq and m6A-seq.
     
A图，RNA测序鉴定Mettl3/Mettl14缺失后mRNA转录水平上/下调的基因。
B图，筛出两种肿瘤中都发生改变的230个基因。
C图，基因本体（GO）分析得出富集通路。
D图，HOMER分析得出CCGAU m6A共同基序高度富集在m6A峰。
E图，甲基化RNA免疫共沉淀测序（MeRIP-Seq）筛出包含Stat1和Irf1在内的55个候选基因。
F图，整合基因组学查看器分析得出Mettl3和Mettl14均在Stat1和Irf1的30UTR(近终止密码子)上沉积。
G-H图，MeRIP-qPCR分别对上述结果进行量化验证和WB验证。
I图，双敲除模型逆转Mettl3/ Mettl14缺失带来的抑瘤表型。
   
总结：Fig.3提示Stat1和Irf1是Mettl3和Mettl14调控的主要靶点。
找到靶标Stat1和Irf1 ，探索的脚步还未停止，想想这部分的实验也许就是你5分文章和人家9分文章区别的关键！
问题四：Mettl3/14敲除后增加Stat1和Irf1 mRNA水平的机制是什么？
IFN-γ是否就是增强抗PD-1免疫应答的关键？（笔者认为Fig4.A、B两图在作者做Fig.2的实验时就已涉及，可能因为文章排版需求，所以放在Fig4部分）

Fig.4 Tumor cells with knockout of Mettl3 or Mettl14 exhibit enhanced response to IFN-γ.

    

A图，Mettl3或Mettl14的缺失可改善肿瘤细胞对IFN-γ的反应。
B图，抗IFN-γ抗体反向验证图A结果。
C图，qRT-PCR验证IFN-γ应答基因表达的转录变化，包括Stat1、Irf1表达增加。
D-E图，qRT-PCR检测经IFN‐γ和放线菌素D处理后的肿瘤，验证了Mettl3/14的缺失后，Stat1和Irf1的mRNA水平升高是mRNA稳定性增强的结果。
F图，WB验证Ythdfs敲除效果。
G图，qPCR分析Stat1和Irf1在Ythdfs敲除细胞中的表达情况，筛出靶标Ythdf2。
H-J图，Mettl3/14过表达和Ythdf2敲减进行正反验证。
总结：Fig.4提示Ythdf2介导的mRNA稳定控制了受Mettl3和Mettl14调控的Stat1和Irf1基因表达点。
医学实验的常规套路，像极了毕论答辩时，答辩专家对你的提问：你做的这玩意儿有啥临床意义吗？

问题五：研究结果具有临床意义吗？

Fig5. The negative correlation of METTL3, METTL14, and STAT1 in human pMMR-MSI-L CRC colon tissue.

A-B图，人pMMR-MSI-L结直肠癌组织中，STAT1蛋白水平与Mettl3和Mettl14负相关。
C图，图示Mettl3和Mettl14在抗肿瘤免疫治疗中的功能和分子机制。
总结：Fig.5提示在人pMMR-MSI-L结直肠癌组织，METTL3和METTL14与STAT1呈负相关。

套路总结

我们从创新维度、逻辑维度、数据维度来评析一下这篇文章：
创新维度：本文创新点在于围绕
①主变量Mettl3/14与表型抗PD-1免疫应答；
②主变量Mettl3/14和效应变量CD8+ T；
③主变量Mettl3/14和效应变量IFN-γ、Stat1、Irf1；
④主变量Mettl3/14与交互变量Ythdf2；
⑤交互变量Ythdf2与效应变量IFN-γ之间关系的建立与论证；
本篇文章效应变量CD8+ T、IFN-γ、Stat1、Irf1与表型抗PD-1免疫应答之间的关系不新，前人已有论证。
逻辑维度：本文运用以下方式论证各变量之间，变量和表型之间的关系
①Mettl3/14与抗PD-1——反向论证：Mettl3/14敲除+抗PD-1；
②Mettl3/14与CD8+ T——反反论证：Mettl3/14敲除+抗CD8+ T；
③Mettl3/14与IFN-γ、Stat1、Irf1——反反论证：Mettl3/14敲除+抗IFN-γ、Stat1和Irf1敲除；
④Mettl3/14与Ythdf2——正反论证：Mettl3/14过表达+Ythdf2敲除；
⑤Ythdf2与IFN-γ——反正论证：Ythdf2敲除+INF-γ干预。
因此，本文包含变量嵌套、分子嵌套，论证格式规范到位，每一条结论的充要论据都完整，没有偷工减料，和酸菜大大传授的套路心法相似度很高。
数据维度：本篇文章数据维度包含细胞、动物、人类标本；多模型、多法标论证，除了文中展示的5张图，补充材料里亦有5张图，数据详实，论证到位。
不知大家怎么看，欢迎大家评论区一起交流~
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