This is the dividing line.
免疫组化技术是现代医学研究中的重要技术，其原理就是抗原-抗体反应及显色反应。免疫组化涉及多个步骤，上手不难，但是做好不容易。因此，小编今天想着和大家聊聊个中细节，旨在交流和学习。答：抗体常分为多克隆和单克隆。抗体识别抗原时依靠的是抗原决定簇。诚然，单克隆抗体具有更高的特异性，可以特异性地标记目的蛋白；但如果前期组织固定不当或者抗原修复不当，极可能出现与单克隆抗体结合的抗原决定簇出现异常，导致结果假阴性；此外，单克隆抗体对反应体系的环境、PH等要求较严格，小编认为不可盲目迷信单克隆抗体。多克隆抗体可识别更多的抗原决定簇，有一些情况下，单克隆抗体无法识别地识别抗原，那么多克隆抗体很有可能发挥奇效；多克隆抗体的劣势是特异性相对没有单克隆抗体好。注意，小编想说的是相对。答：孵育时间与抗体的滴度呈反比。对于免疫组化而言，恒定地孵育时间是必须保证的，否则总体染色质量和染色强度会有较大差异，孵育温度越高，差异越明显。目前很多公司的抗体是能够支持4℃过夜孵育和37℃恒温孵育的。二者均可，但是对于一个完整地研究来说，不同的指标均应该采用相同的孵育温度和时间，这是很重要的。答：二抗在免疫组化中起到重要的桥梁作用，也是保证染色结果稳定的因素。众所周知，不同公司生产的二抗效价是不一样的。有人曾经做过研究，发现这种差异是具有统计学意义的。免疫组化本身涉及多个步骤，重复性并不好。因此，小编建议大家摸索好某一个品牌的二抗及其相应浓度，以后就尽量不要更换品牌了，这样能够有效地减少二抗的品牌差异带来的数据偏离。答：抗原修复的好坏直接决定免疫组化的成败。抗原修复有很多种方法，包括微波炉法(操作方便，但是染色弱，易出假阴性)、高压锅法(染色效果很好，但可能易脱片)、水浴法(使用较少，步骤多)等等。因此，目前还没有一种公认的理论来解释抗原修复的过程。有一种解释，小编认为比较好理解：甲醛固定导致抗原交联，而修复可以打开抗原交联，暴露抗原结合位点。事实上，甲醛固定后带来的变化和抗原本身复杂性远不止于此。修复时把握2点：修复液要加热到95℃-100℃，一般维持此温度15-20min即可；让切片在修复液中自然冷却至室温，不要用冷水骤然降温。抗原修复液不要回收！常规高压修复法：切片常规脱蜡入水后，去离子水漂洗3次*2min；高压锅修复10min；去离子水漂洗3次*2min；PBS漂洗3次*2min，继续免疫组化步骤。组合修复法：切片常规脱蜡入水后，去离子水漂洗3次*2min；3%过氧化氢孵育5min左右；去离子水漂洗3次*2min；0.01%枸橼酸钠溶液PH6.0微波热修复，98℃，15-20mim，目的是增加胞膜和核膜的通透性；自然冷却至室温后，PBS漂洗3次*2min；1%胰酶PH9.0室温孵育15min，目的是消除甲醛固定后对抗原带来的不利影响；PBS漂洗3次*2min，然后接免疫组化步骤。答：采用阳离子防脱玻片，制片后烤片1h，烤片温度55-60℃，可以很好地保证抗原活性。常规玻片这样做可能有脱片风险，建议还是选择阳离子防脱玻片。有病理技术专家测试过，一般情况下，温度过高(超过60℃)或时间过长(过夜烤片超过16h)，会一定程度地降低抗原免疫活性。答：很多人觉得DAB不重要，实际上，DAB直接关系到免疫组化结果。有过免疫组化经验的小伙伴肯定知道DAB显色时间长短对染色强度的重要影响。现在大家基本都会使用即用型DAB试剂，即DAB浓缩液和DAB稀释液按照一定比例配制，现配现用型。DAB浓缩液一般由DAB粉末和Tris缓冲液配制而成，建议大家将其存储在-20℃冰箱，避光保存。DAB稀释液，其成分就是0.3%过氧化氢，见光易分解，建议避光4℃保存。最好的DAB工作液PH应该在7.0，建议大家使用前用PH试纸测一测。非常值得注意的是DAB具有强致癌性，小伙伴们应该做好防护措施。答：免疫组化最常遇到的就是非特异性染色了，这会给我们的分析造成很大的影响，目的蛋白染色较浅时尤其如此。在排除切片过厚、染色过程中干片、DAB过度染色或洗涤不充分等一般性问题之后，大家可以考虑以下方法。做肝、肾或者肿瘤研究的伙伴应该注意内源性生物素的影响，鉴于此，可延长内源性过氧化物酶孵育时间和血清封闭时间，能够一定程度地减少非特异性染色。如果还有的话，可以分2步考虑。第一，采用PBS代替二抗或三抗，排除二抗、三抗的原因；第二，换一种修复方法，抗体说明书仅是参考，在别无他法的情况下可以适当变通，即之前采用PH6.0修复液的可更换采用高PH修复液体，。另外，一些存放很久的蜡块或切片容易出现非特异性染色，此时PH6.0修复液比PH9.0修复液效果要好一点。答：切片洗涤占了整个实验过程的很大一部分时间。我们常说的漂洗切片，实际上是将切片泡在PBS中，而不是真正的冲洗切片，那样肯定会脱片。有条件的课题组，可以考虑买一个微量振动台，切片漂洗可放在台上，大大缩短漂洗时间。没有条件的，可以考虑使用ELISA平板振动台或者常规的平板摇床。
答：常规修复方法小编就不说了，这里介绍一种改良方法，是小编在一本书上看到的。首先常规制作冰冻切片；漂洗后过氧化氢室温避光孵育10min左右；去离子水漂洗3次*2min；PH6.0修复液，微波法修复重复3次；BSA封闭20min；一抗孵育半小时；二抗孵育20min；显色。这种方法可以有效地增强染色效果，并且缩短染色时间。小编自己没试过，如果有小伙伴感兴趣，可以做做预实验试试。答：这个实验几乎全程在湿润环境下进行，干片最易发生的步骤是一抗孵育环节，其次就是组织的边缘区容易干片。在滴加抗体之前，轻微的干片带来的影响不大，但是加了抗体后的步骤绝对不能干片。建议大家用免疫组化专用笔在组织周画个圈(圈要离组织外缘3mm)，这样滴加试剂就不会在切片上流失。小编啰嗦一句，用免疫组化笔时不要太用力，否则里面的液体会顺着笔尖流下来，沾到组织上就再也洗不掉了。组织边缘的干片有时很难避免，所以很多人做的免疫组化组织边缘存在一圈淡淡的棕黄色，这就需要小伙伴们多多加液，细心实验了；同理，后期分析时也尽量不要在组织边缘区做太多思考。今天就先说到这里，之后会进一步地针对某些组织的免疫组化染色和大家交流。
This is the dividing line.
以上为本期内容，免疫组化染色技术。
