6 分肝癌单基因生信文章结合少量实验验证
Comprehensive analysis of ubiquitin-specific protease 1 reveals its importance in hepatocellular carcinoma
泛素特异性蛋白酶1的全面分析显示其在肝细胞癌中的重要性
一、研究背景
HCC是最常见的原发性肝癌。目前研究人员正在关注肝癌的早期诊断，转移和复发的预防，新预后标志物和治疗选择。然而，晚期HCC患者的治疗选择仍然有限。因此，进一步了解HCC发生发展机制非常重要，寻找新的治疗靶标仍然是当前研究的重点。
泛素化是活性蛋白翻译后修饰的一种，会导致肿瘤发生途径的抑制或发展。靶向去泛素酶已被引入作为HCC的一种新型治疗方法。然而，还需要更多数据来证明该策略的有效性。USP(半胱氨酸依赖性蛋白酶)，构成了去泛素化酶的最大亚家族，在细胞稳态和DNA损伤反应中至关重要。USP1及其辅助因子USP1相关因子1(WD重复结构域48/WDR48)，在DNA损伤反应过程中起调节作用。通常，USP1和WDR48形成一个复合体并发挥功能，WDR48通过稳定其表达和介导其与底物的接触来显著增强USP1的活性。USP1是有希望的癌症治疗靶标。但是，目前对其在HCC中的作用了解有限。
二、研究思路
三、结果解析
1、USP1在肝癌中的高表达
在Oncomine数据库中进行数据挖掘后，与正常组织相比，USP1的mRNA表达在各种类型的癌症中均升高，例如肝癌，肉瘤和膀胱癌(图1A)。然后，进一步关注了它在HCC中的表达。从4个数据集Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver中选择了数据并对USP1表达进行了meta分析，从而进行四个研究的比较(图1C)。
结果表明，与正常组织相比，USP1在肝癌组织中显著上调。在Roessler Liver，Roessler Liver2，Chen Liver和Wurmbach Liver数据集中，USP1分别显示HCC升高2.364倍，2.064倍，1.810倍和1.411倍(图1B)。此外，使用HPA数据库分析了USP1蛋白的表达。大多数类型的癌症均表现出USP1阳性染色。图1D显示了正常肝脏的图像和HCC肝脏的图像。在正常肝中未检测到USP1，在HCC肝中显示弱至中度染色。
图1.USP1的mRNA在HCC中高表达
为了提高结果的可靠性，使用UALCAN数据库进一步验证了TCGA的LIHC数据中USP1 mRNA显著过表达。如图2A所示，与正常样品相比，LIHC样品中USP1的mRNA表达升高。亚组分析显示，USP1在肝癌的不同亚组中也被上调，包括性别，年龄，种族和体重亚组(图2B-E)。关于癌症分期和肿瘤等级，USP1在1-3期和1-4级中过表达(图2F，G)。此外，USP1在无区域淋巴结转移的HCC患者中过表达，而在有转移的患者中则未过表达(图2H)。USP1与TP53突变状态呈正相关且在具有TP53突变的HCC患者中显著过表达(图2I)。
综上可得，USP1的高表达与肿瘤进展密切相关。
图2.HCC中USP1的亚组表达分析(*P <.05，** P <.01，*** P <.001)
2、USP1在HCC患者中的预后意义
由于USP1的高表达与肿瘤进展密切相关，于是推测USP1可以作为HCC患者的预后标志物。使用Kaplan-Meier绘图仪数据库评估了USP1在HCC患者中的预后意义。USP1高表达与HCC患者的OS，RFS，PFS和DSS有关(图3A-D)。此外，USP1的高表达还与男性，亚洲人和非饮酒的HCC患者OS不良有关(图3E-G)，而女性，白人和饮酒的HCC患者则与OS不良无关(图3I-K)。对于肝炎病毒感染或非肝炎病毒感染的患者，USP1高表达预示其生存期较差(图3H，L)。总之，USP1高表达与肝癌患者预后差有关。
图3.USP1的高表达预示HCC的不良预后
3、HCC中USP1的突变
在cBioPortal数据库中评估了USP1在HCC中的突变频率。选择了五个数据集进行了分析。USP1在肝癌中的体细胞突变频率为0.3％，主要由错义突变组成(图4A)。此突变频率相对较低，每1000个样本中只有3个。因此，未能找到USP1突变与HCC患者的预后之间的关系。
在另一个数据库COSMIC中进一步评估了USP1的突变类型图4中显示了两个突变类型的饼图。在大约44.44％的样本中发生了错义替换，在11.11％的样本中发生了同义替换，在11.11％的样本中发生了移码删除(图4B)。取代突变主要发生在T> C(40.00％)，然后是A> C(20.00％)，A> G(20.00％)和A> T(20.00％)(图4C)。
图4.HCC中的USP1突变
4、HCC中USP1表达与免疫浸润的关系
使用TIMER数据库研究了USP1表达与免疫浸润的关系。使用Spearman检验(使用肿瘤纯度进行调整)分析了USP1表达与六种免疫浸润物(B细胞，CD8+T细胞，CD4+T细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突状细胞)丰度之间的相关系数。发现USP1表达与肿瘤纯度有轻微正相关。此外，USP1表达与所有六个免疫浸润物，尤其是嗜中性粒细胞和巨噬细胞有显著正相关(图5)。此外，分析USP1表达与相关免疫细胞基因标志物之间的相关性。与上述结果一致，USP1与几乎所有选定的免疫细胞的基因标志物都有显著的正相关。其中排名前五位的基因标志物是GATA3，CCR8，STAT5B，BDCA-4和STAT1。(表1)
综上，USP1在HCC发生过程中在免疫浸润中起关键作用的结论。
图5.USP1与HCC中的免疫浸润有关
表1.HCC中USP1与免疫细胞基因标志物之间的相关性
5、WDR48高表达与USP1相关，并预示肝癌患者预后不良
为了揭示USP1辅助因子WDR48在肝癌中的作用，评估了其表达和预后意义。使用UALCAN数据库，WDR48在HCC中也明显过表达(图6A)。根据已有知识，WDR48在HCC中的表达与USP1正相关(GEPIA，图6B)。有趣的是，发现高WDR48表达还与HCC患者的OS和RFS差有关(图6C，D)。
图6.WDR48在HCC中过表达，并预示不良预后
6、与HCC中USP1和WDR48相关的差异基因
使用LinkedOmics数据库和Spearman检验鉴定与USP1和WDR48相关的差异表达基因(图7A、USP1和不同表达的基因之间的相关性，D、WDR48和不同表达的基因之间的相关性)。热图显示了前50个正相关和前50个负相关的基因(图7B，C，E，F)。根据Spearman检验，选择系数> 0.4的正相关基因。
图7.与HCC中USP1或WDR48相关的差异表达基因
最后，选择了与USP1正相关的1175个基因和与WDR48正相关的199个基因。其中98个基因与USP1和WDR48均呈正相关，并选择这些基因进行进一步分析(图8A)。将98个差异表达的基因输入到STRING和Cytoscape中以构建PPI网络(图8B、98个基因与最重要的簇的相互作用网络显示为黄色)并使用使用DAVID进行GO和KEGG富集分析。分析得到以下生物过程受到显著影响：转录，转录调节，共价染色质修饰等(图8C)。细胞成分主要富集于核质，核，中心体等(图8D)。分子功能主要集中在DNA结合，染色质结合，蛋白质结合等方面(图8E)。KEGG结果显示，共表达的基因主要参与细胞周期，醛固酮合成和分泌以及雌激素信号通路(图8F)。
图8.与USP1和WDR48正相关的基因的功能分析
7、HCC中的中枢基因的鉴定及其预后价值
首先，使用MCODE识别了PPI网络中最重要的簇(图8B，以黄色显示)，随后使用cytoHubba(按等级排列)确定了网络的前十个中枢基因(图9A、前十位中枢基因的相互作用网络)。GO分析结果表明，生物学过程(例如染色质重塑，共价染色质修饰和染色质结合)受到显著影响和富集(图9B)。最后，在Kaplan-Meier Plotter中评估了中枢基因的预后价值。结果表明，在这10个基因中，7个基因(BPTF，SETD2，SMARCC1，UBXN7，SMC3，PBRM1和SF3B1)的高表达与不良OS显著相关(图9C，预后价值)，而其他三个基因则无意义(ATRX，SIN3A和USP34)。
图9.中枢基因分析
8、验证HCC细胞系中USP1和WDR48之间的相互作用
首先，使用蛋白质印迹法检测了USP1和WDR48的表达。发现在MHCC97H和SKHep-1中，HCC细胞系中USP1和WDR48的蛋白质水平高表达(图10A)。然后，使用靶向USP1的siRNA敲除了这些细胞系中的USP1。在siRNA-USP1转染后，与NC-siRNA转染的细胞相比，USP1在蛋白质和mRNA水平上均显著下调(图10B，C，E，F)。此外，在MHCC97H和SK-Hep-1细胞中，USP1敲除显著降低了WDR48(图10B，C，E，F)。这些结果通过特定的USP1抑制剂ML-323进一步验证。经过50μmol/ L ML-323处理24小时后，USP1和WDR48在MHCC97H和SK-Hep-1细胞中均下调(图10D)。此外，使用共免疫沉淀法证实了HCC细胞系中USP1和WDR48之间的相互作用，结果表明USP1与MHCC97H和SK-Hep-1细胞中的WDR48有相互作用(图10H）。
图10.USP1和WDR48在MHCC97H和SK-Hep-1细胞中的功能分析
9、SiRNA-USP1转染或ML-323处理可降低HCC细胞的增殖
图8F表明共表达的基因主要参与细胞周期。因此，研究了USP1在HCC细胞增殖中的作用。
首先，将siRNA-USP1转染到MHCC97H和SK-Hep-1细胞中进行CCK-8测定以评估细胞活力和细胞增殖能力。结果表明，USP1基因敲除显著抑制了MHCC97H和SK-Hep-1细胞的增殖(图10G)。USP1敲除后，增殖细胞核抗原(PCNA)(USP1/WDR48,44的细胞靶标之一)显著降低。此外，USP1敲除还降低了细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1的表达，从而通过细胞周期停滞抑制了肝细胞的生长45(图10C，E，F)。此外，ML-323处理还降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的蛋白表达。因此，得出结论，靶向USP1可以减少HCC细胞的增殖。
四、小结
USP1在调节DNA修复中具有重要作用，因此被研究人员视为肿瘤的潜在治疗靶点。文章是以问题为导向而开展。
USP1在肝癌中发生了哪些改变：突变改变，表达改变或两者兼有？
这些改变是否具有临床意义，是否与患者的预后有关？
USP1在肝癌中的潜在机制是什么？
使用信息工具系统地分析USP1在肝癌中的作用并证实了USP1在肝癌组织中的表达高于正常组织，且USP1的高表达显示出临床意义，并与HCC患者的不良生存有关。结果表明，USP1是肝癌的潜在治疗靶标。机制目前仍不清楚。
为什么USP1的高表达与患者的不良生存相关？
发现USP1的高表达与免疫浸润呈正相关，表明USP1在HCC发生过程中在免疫浸润中起关键作用。此外，使用免疫共沉淀法证实了USP1-WDR48在HCC细胞中的相互作用。因此，假设USP1-WDR48复合物通过稳定底物的活性在肝癌中起关键作用。为了鉴定这些重要的底物，使用GO分析，KEGG富集分析了与USP1和WDR48正相关的HCC差异表达基因的生物学功能，同时还识别了10个中枢基因，其中7个基因在HCC患者中具有预后价值。这表明，USP1-WDR48复合物通过稳定和去泛素化这些中枢基因而在肝癌中发挥了促进肿瘤的作用。综上，USP1的功能取决于其辅助因子WDR48，这给予了开发特定治疗策略的机会。本篇文章还证明siRNA -USP1转染或ML-323处理可降低HCC细胞的增殖。USP1敲除或ML-323处理降低了PCNA，cyclin D1和cyclin E1的表达，这意味着靶向USP1可以通过细胞周期停滞降低HCC细胞的增殖。
本篇文章也有局限性。首先，用于分析的大多数数据均来自公共数据库，并在体外实验中得到验证，某些结果可能需要在未来进一步验证。其次，除了USP1的表达改变外，还应注意其活性的改变。但尽管如此，仍可以得出结论，USP1是治疗HCC的有希望的治疗靶标。
编辑：邓慧
校审：刘安洋 林安琪