山东大学祁庆生团队通过改造解脂耶氏酵母转运蛋白实现生物基丁二酸的高效生产
背景
图1 解脂耶氏酵母中丁二酸合成及外排路径示意图
丁二酸（又名琥珀酸）是一种重要的C4平台化学品，是合成生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯PBS和聚丁二酸-己二酸丁二酯PBSA的主要原料。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为一种非常规酵母，具有较强的三羧酸循环代谢通量，且能耐受低pH条件，因此可以作为丁二酸生产的潜在平台。转运蛋白工程是提高微生物细胞工厂底物利用率和产物分泌速率的有效代谢改造策略。增强最终产物的胞外运输不仅可以减少反馈抑制和细胞毒性，还可以改变反应平衡，促进下游反应的进行。解脂耶氏酵母中丁二酸的主要合成部位是线粒体基质，丁二酸必须穿过线粒体内膜和细胞膜才能实现细胞外分泌（如图1）。近日，山东大学祁庆生教授团队以先前构建完成的丁二酸生产菌株PGC62作为平台，鉴定了解脂耶氏酵母中负责丁二酸外排的内源性线粒体转运载体，并探究了异源C4-二羧酸转运蛋白过表达对丁二酸合成的影响。最后，通过组合优化丁二酸合成相关途径构建高效底盘细胞，并进一步评估丁二酸转运蛋白的功能。在分批补料发酵中，最终工程菌株PGC62-SYF-Mae的丁二酸产量达到101.4 g/L，这是酵母宿主以葡萄糖作为唯一碳源发酵丁二酸获得的最高产量。该成果发表在国际期刊Biotechnol Biofuels上，通讯作者为山东大学微生物技术研究院祁庆生教授和侯进教授，硕士研究生姜振楠和博士后崔志勇为本文共同第一作者。该研究得到国家重点研发计划和中国博士后科学基金等项目的资助。
内容
1. 鉴定解脂耶氏酵母中的线粒体羧酸转运蛋白线粒体载体（MCs）定位于线粒体内膜上，负责介导线粒体基质与细胞质之间有机酸，氨基酸，核苷酸和一些辅因子等代谢产物之间的交换。根据先前的报道，解脂耶氏酵母基因组中共含有39个线粒体载体家族编码基因，作者在PGC62中过表达了五种可能与羧酸运输有关的MCs，期望促进丁二酸从线粒体高效外排的相关兴趣转运载体。如表1，所有过表达MC的改造菌株与对照相比，丁二酸产量均得到了不同程度的提升。最终的实验结果表明，改造菌株PGC62-YlDic的发酵性能是所有改造菌株中最优的，其丁二酸的产量相比对照菌株提升了28.9%，因此作者推测线粒体二羧酸转运蛋白YlDic可能与丁二酸的胞内转运具有密切关联。
表1 解脂耶氏酵母中潜在的线粒体丁二酸转运载体编码基因
为了进一步探索目标蛋白YlDic的功能作用，该团队分别设计了三种用于基因敲除的质粒，通过CRISPR介导的方法尝试敲除出发菌株PGC62的YlDic1基因，但是在进行了多次尝试后始终没有成功突变YlDic。因此猜测该蛋白的失活有可能会影响解脂耶氏酵母的生长和细胞代谢，故不易或者无法被敲除。然后，作者又尝试设计了三种抑制YlDic基因的质粒，将将该菌株同改造菌株PGC62-YlDic和对照菌株PGC62进行横向比较如图2所示，在发酵前24h的时间里，PGC62-YlDici菌株与对照菌株PGC62无论在生长方面还是丁二酸积累方面均无明显差异。但是以24h为节点一直到72 h的时间段中，可以非常明显的看到YlDic基因的抑制在一定程度上影响了细胞的生长和丁二酸的产生，而过表达YlDic的菌株则显示出比对照菌更有优势的发酵性能。综上结果表明，解脂耶氏酵母中的YlDic转运载体在丁二酸的外排过程中起到了关键作用。
图2 抑制或过表达YlDic基因对解脂耶氏酵母
(a) 细胞生长和(b) 丁二酸生产的影响。
2. 筛选增强丁二酸的分泌的C4-二羧酸转运蛋白
为了筛选到能够在解脂耶氏酵母中高效分泌丁二酸的羧酸转运蛋白, 研究人员首先挑选出已被充分研究过的粟酒裂殖酵母来源的SpMae1作为参考，然后根据氨基酸序列相似性，在NCBI数据库中选定了十余种候选转运蛋白以构建系统发育树。接着从中选取了九种候选蛋白在密码子优化后，利用NHEJ介导的基因组整合技术在PGC62菌株中进行相关基因的过表达（图3a）。从得到的发酵结果来看，粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母来源的羧酸转运蛋白的过表达分别使得丁二酸产量提高了39%左右水平（图3b）。该结果证实了SpMae与YlMae1很有可能是解脂耶氏酵母中丁二酸等有机酸分泌的关键羧酸转运蛋白。
图3 不同物种来源C4-二羧酸转运蛋白对解脂耶氏酵母丁二酸合成的作用
a 不同物种来源的二羧酸转运蛋白的系统发育树；b 九种二羧酸转运蛋白过表达菌株的丁二酸发酵表征
根据先前文献报道，SpMae1在发挥其转运功能时并不依赖质子原动力，因此比其他很多二羧酸转运蛋白更节省能量。SpMae1已被广泛应用于提高微生物生产苹果酸，丁二酸和富马酸，因此可进一步修饰以提高丁二酸的生产水平。
3. 优化丁二酸的生物合成代谢途径
为了实现丁二酸的高效生产并进一步表征转运蛋白的功能，研究人员期望通过优化丁二酸生物合成途径的表达，得到一株性能优良的解脂耶氏酵母底盘菌株。为实现此目标，作者以PGC62作为出发菌株，分别从氧化TCA途径、还原TCA途径和乙醛酸循环三条支路对该菌株进行工程设计。最终，通过结合三种丁二酸生物合成途径的组合优化，构建了一株具有较高丁二酸生产能力的底盘菌株PGC62-SYF (图4b)。
图4 (a) 不同代谢途径组合优化后的改造菌株在72h时的丁二酸产量及转化率情况; (b) PGC62-SYF菌株在摇瓶水平下的发酵情况
4. SpMae1对细胞生长和丁二酸生产的影响
为了进一步评估筛选得到的羧酸转运蛋白的功能，作者在PGC62-SYF平台菌株中分别了表达细胞膜羧酸转运蛋白SpMae和线粒体转运蛋白YlDic，得到PGC62-SYF-Mae菌株和PGC62-SYF-Dic菌株。如图5所示，发酵性能最佳的改造菌株PGC62-SYF-Mae在摇瓶发酵过程中产生的丁二酸为35.1g/L，此结果在PGC62-SYF平台菌株的基础上又提高了26.5%，这也使得羧酸转运蛋白SpMae的功能在PGC62-SYF底盘菌株中又一次得到了证实，验证了该蛋白高效的丁二酸转运分泌能力。
图5 不同改造菌株的发酵特征比较
(a) 不同改造菌株丁二酸生产情况；(b)不同改造菌株生长情况。
5. 丁二酸高产菌株PGC62-SYF-Mae的分批补料发酵
为了进一步评估高产菌株的丁二酸生产潜力，作者又在发酵罐中进行了分批补料放大发酵试验。如图6所示，研究人员首先进行了发酵罐水平下的不同菌株发酵性能的横向比较，与摇瓶水平的结果相同，PGC62-SYF-Mae菌株依然是最佳的丁二酸高产菌株。接着作者通过进一步优化pH、通气量、溶氧和碳源浓度等条件使得该菌株的丁二酸的最终产量达到了101.4g/L（图7），这也是迄今为止以葡萄糖为唯一碳源的真核微生物所达到的最高丁二酸产量。另外，生产力和转化率方面分别达到0.70g/L/h和0.37g/g葡萄糖，这些结果表明，工程菌株PGC62-SYF-Mae可以有效的实现葡萄糖利用和丁二酸的生产。
图6 1L发酵罐中丁二酸发酵的条件的优化。a 不同工程菌株丁二酸产量及转化率的比较。b 不同工程菌株在发酵罐中的生长情况。c 不同pH环境下的丁二酸的产量和转化率d 不同培养条件下的丁二酸的产量和转化率
图7 在发酵罐中对PGC62-SYF-Mae菌株进行分批补料发酵期间的细胞生长、糖耗和丁二酸产量的动力学曲线
总结
该研究为解脂耶氏酵母利用葡萄糖生产丁二酸提供了一种转运蛋白工程策略。首先，通过初筛得到了几种与丁二酸转运相关的转运蛋白；同时利用传统的代谢工程手段对解脂耶氏酵母的丁二酸合成途径进行理性化改造；随后综合两者构建了工程菌株PGC62-SYF-Mae。最终，该菌株在放大发酵试验中的丁二酸的产量达到101.4g/L，这是酵母宿主以葡萄糖作为唯一碳源发酵丁二酸获得的最高产量。本研究构建的丁二酸高产菌株有助于开发可持续和低成本的生物丁二酸生产方法，并有望在工业生产中发挥出巨大的应用价值。
供稿：刘津铭
审核：崔志勇
编辑：张彤 徐娅 李晓萌
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