控制细胞运动的蛋白质的巧妙结构 - -癌细胞浸润、转移相关的g蛋白复合体的结构分析-
物理化学研究所 日本医疗研究开发机构 控制细胞运动的蛋白质的巧妙结构 - -癌细胞浸润、转移相关的g蛋白复合体的结构分析-
理化学研究所(理研)生命机能科学研究中心蛋白质机能结构研究小组白水美香子小组组长、新野睦子高级研究员组成的研究小组指出，促进细胞运动的蛋白质是其结合伙伴“ELMO1[2]” ”的激活g蛋白质[3]的结构，通过使用低温电子显微镜法[4]的高分辨率结构分析进行了解释。 本研究成果，可望对治疗与细胞的运动性密切相关的浸润癌的创药研究做出贡献。 细胞的运动参与了身体的各个重要过程，包括免疫应答、神经突起的形成和癌症的转移。 g蛋白Rac[3]通过调控肌动蛋白细胞骨架[5]诱导细胞的形态变化，促进癌细胞的运动。 DOCK家族蛋白质承担着激活Rac的作用，但其功能需要与ELMO[2]蛋白质结合。 但是，ELMO如何帮助DOCK的功能还是个谜。 研究小组此次表明，通过基于低温电子显微镜法的立体结构分析和基于决定的结构的ELMO1突变体的功能分析，ELMO1与DOCK5正在被激活的Rac1结合，提高了其激活效率。 ELMO1帮助激活Rac1的机制，被认为是选择性激活Rac的其他DOCK家族蛋白质的共同之处。 本研究刊登在科学杂志《科学高级》在线版( 7月21日:日本时间7月22日)上。
结合到细胞膜时的ELMO1-DOCK5-Rac1复合体的预想图
背景 DOCK蛋白质家族是从酵母菌、线虫等微生物到人类进化保存的分子群，在细胞运动的调节中起着重要的作用。 DOCK蛋白质通过将与Rac和Cdc42[3]等g蛋白质结合的GDP (鸟苷二磷酸)交换为GTP (鸟苷三磷酸)，从而活化这些GD蛋白质。 被活化的g蛋白促进细胞骨架肌动蛋白的聚合，通过改变细胞的形态来控制细胞的运动。 已知Rac与癌细胞向运动方向延伸的膜突起的形成有关。 DOCK蛋白质有功能不同的多个域，负责将与Rac结合的GDP交换为GTP的反应的是被称为“DOCK同源域2(DHR-2 )”的域。 另外，该反应认为需要通过其他结构域“DHR-1”结合到细胞膜上。 DHR-1和DHR-2是哺乳类的所有DOCK蛋白质家族共有的域。 另一方面，DOCK蛋白质家族中的5种( DOCK1~DOCK5)又具有“Src同源3(SH3 )”作为第三个结构域，据此与结合伙伴ELMO蛋白质结合。 在试管内的实验表明，DHR-2结构域单独也可以活化g蛋白质，但为了使这些DOCK蛋白质在细胞内发挥作用，与ELMO结合是不可缺少的。 也就是说，细胞的运动被认为是由Rac、DOCK、ELMO的复杂相互作用控制的，如果弄清楚这个结构，就有可能发现抑制癌症浸润·转移的方法。 但是，虽然此前已知DOCK和ELMO的部分结构，但整体结构分析很困难，不太清楚这些蛋白质结合的活性控制机制。 在前期研究中，鉴定了控制免疫应答的关键分子DOCK2和ELMO1的结合区域，通过这些区域，解释了两个蛋白质形成复合体，解除彼此自身抑制的结构。注1 )。 这次，研究小组尝试观察了ELMO1与通过DOCK5激活Rac1有什么关系。 注1 ) 2012年2月14日新闻发布会“在原子水平上阐明免疫系统细胞对刺激做出响应而活动的结构”
研究方法和成果 研究小组利用低温电子显微镜观察了结合Rac1时的ELMO1-DOCK5复合体的结构。 利用得到的高分辨率立体像，分析DHR-1、DHR-2、SH3各结构域的结构，进而对未知区域进行三级结构预测计算，最终成功用几乎原子水平的3.8埃(Å、1Å为100亿分之一米)的分辨率决定了除c末端[6]区域以外的几乎完全长的DOCK5(全长1，840氨基酸残基中的1，642氨基酸残基)的结构。 ELMO1-DOCK5-Rac1复合体形成了主要由α-螺旋[7]构成的复杂复合体，是两个复合体缔合而成的二聚体结构(图1左)。 可以认为，该二聚体呈以DOCK5的DHR-2结构域为中心的双旋转对称结构，通过位于两端的DHR-1结构域朝向相同的方向，能够稳定地与细胞膜结合(图1右)。
图1细胞运动中ELMO1-DOCK5复合体对Rac1的活化
(左)低温电子显微镜下观察到的ELMO1(橙)-DOCK5(蓝)-Rac1 (黄)复合体的二聚体结构。
(右)与细胞膜结合时的ELMO1-DOCK5-Rac1复合体的预想图。 DOCK5通过DHR-1结构域结合到细胞膜上。 结合在膜上的Rac1的c末端区域用虚线表示。
如果详细观察复合体结构中的DOCK5、Rac1、ELMO1的结合方式，就会发现像三者相向的三巴(图2A )。 也就是说，ELMO1的c末端区域( PH域)从与DOCK5的DHR-2域不同的方向与Rac1结合，同时也与DHR-2域结合，支撑着激活Rac1的DHR-2域的结构。 迄今为止，已知Rac1和DHR-2域的耦合模式，但这一次首次证明了耦合伙伴ELMO1和Rac1的直接相互作用。 另一方面，还发现ELMO1的n末端[6]侧，此次分析的复合体不能采取一定的稳定结构。
图2辅助基于2 DOCK5的Rac1活性化的ELMO1的PH域 ( a ) ELMO1通过PH域和Rac1之间的特异性相互作用，使DOCK5的DHR-2域和Rac1的结合稳定化。 ( b )向ELMO1-DOCK5复合体的ELMO1(PH域)导入2处变异(将D647和N649的氨基酸残基置换为丙氨酸)时，发现对Rac1的GDP/GTP交换活性降低。
今后的期待 已知DOCK5促进上皮细胞的浸润、转移，参与癌症的发展。 另外，DOCK5控制着破骨细胞骨吸收时与骨的粘附功能，是抗骨质疏松症药物的开发目标而备受期待的分子。 从本研究开始，今后对调节DOCK5和其他DOCK家族蛋白质的g蛋白质活性的结构的理解将进一步加深，对于这些疾病，期待着开发新的治疗药物的道路。
补充说明 1 .DOCK5DOCK蛋白质是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子，具有使GDP背离GDP结合型(惰性型) Rac蛋白质，促进向GTP结合型的转换的功能。 组成功能相似的蛋白质家族，哺乳类的DOCK家族蛋白质中含有11种DOCK蛋白质，DOCK5是其中之一。 DOCK是dedicator of cytokinesis的缩写。 2.ELMO1、ELMO ELMO是一种与多种蛋白质结合，成为蛋白质复合体形成的“支架”的蛋白质，ELMO1就是其中之一。 ELMO是Engulf ment和cell motility的缩写。 3.G蛋白、Rac、Rac1、Cdc42 g蛋白质是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质的总称。 在鸟苷二磷酸( GDP )结合的惰性型和鸟苷三磷酸( GTP )结合的活性型之间蛋白质的结构发生变化，作为分子开关发挥作用。 在从人类白血病细胞株鉴定的Rac和酵母细胞中发现的Cdc42，与调节细胞运动等的信号传递有关。 Rac1是Rac之一。 4 .低温电子显微镜法 蛋白质等试样在液体乙烷中急速冻结，封在薄冰层中，使用透射型电子显微镜进行观察的方法。 通过图像处理，可以得到观察到的粒子的立体结构信息。 5 .肌动蛋白细胞骨架 是调节细胞运动所需的纤维状结构，由丝切蛋白聚合形成。 成为癌细胞浸润时细胞膜上形成的突起结构的中心。 6.C末端、n末端 蛋白质是氨基酸之间脱水缩合形成的聚合物，邻接的氨基酸中各个氨基酸和羧基形成肽键。 将该聚合物末端自由的氨基一侧称为n末端，羧基一侧称为c末端。 7.α-螺旋体 蛋白质的二级结构之一。 多肽链呈右旋螺旋结构，通过氨基和羧基之间的氢键而稳定化。
研究小组 理化学研究所生命机能科学研究中心 蛋白质功能结构研究小组 队长白水美香子 高级研究员新野睦子 工程师桂一茂 研究员横山武司 专业技术员加茂友美 工程师(研究当时)津曲千惠美(即千惠美) 工程师池田真理子 工程师花田和晴 创药蛋白质分析基础单元 技术人员ⅰ米持麻友美 转录调控结构生物学研究小组 研究员江原晴彦 分子序列比较分析小组 专业研究员中川丽子 结构生物信息学研究小组 球队队长凯姆察( Kam Zhang ) 研究员拉尔夫·考西克( Rahul Kaushik )
研究支援 本研究由理化学研究所运营费补助金(生命机能科学研究)实施，是在日本学术振兴会( JSPS )科学研究费补助金基础研究( c )“基于多种领域合作的RhoGEF控制机构的阐明(研究代表者:柊元睦子)”、该基础研究( c )、“调节细胞运动的蛋白质” 该基础研究( b )“蛋白质结构设计计算方法的研究开发及实验验证(研究代表者: ZHANG KAM )”、 日本医疗研究开发机构( AMED )创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS )“面向综合结构解析的高难度复合体的生产支援和高度化(研究代表者:白水美香子)”、“基于低温电镜的细胞内母语复合体结构分析(研究代表者:吉川雅英)”的支援下进行的。
原论文信息
Mutsuko Kukimoto-Niino, Kazushige Katsura, Rahul Kaushik, Haruhiko Ehara, Takeshi Yokoyama, Tomomi Uchikubo-Kamo, Reiko Nakagawa, Chiemi Mishima-Tsumagari, Mayumi Yonemochi, Mariko Ikeda, Kazuharu Hanada, Kam Y. J. Zhang, Mikako Shirouzu, "Cryo-EM structure of the human ELMO1-DOCK5 complex", Science Advances, 10.1126/sciadv.abg3147
发表者 物理化学研究所 生命功能科学研究中心蛋白质功能结构研究小组 队长白水美香子 高级研究员新野睦子