杂交捕获 之 非特异性杂交

写在前面：

本次更新主要介绍杂交捕获中出现非特异性杂交的问题，以及如何尽量有效避免非特异性杂交。

1.非特异性杂交是怎么出现的？

杂交捕获，顾名思义就是把我们需要的目的片段通过与探针特异性结合的状态捕获出来。然而在这个过程中往往会出现一些非特异性的杂交。

说起非特异性杂交，可能每个做杂交捕获的人大都碰到过这个问题，而且实验中出现非特异性杂交，可能直接使得洗脱后杂交文库浓度偏高，进一步导致上机测序中靶率差，最终造成测序失败。到底在杂交捕获的过程中非特异性杂交是怎么出现的？这还得从杂交的源头说起。

上一期小编介绍了杂交体系中相关试剂和其作用，先看看试剂的影响：

①当Human Cot DNA（作用：封闭大量重复的DNA序列，避免非特异性杂交）漏加/加入不足时,可能会造成基因组片段中大量的重复序列未得到较好的封闭，从而它们之间发生互补配对，探针在捕获目的片段时“顺手”牵扯到非特异性片段：

注：图中A为Human Cot DNA（黄色表示）封闭较好，未出现非特异性杂交；B表示由于目的片段中重复序列未得到较好的封闭，故在捕获到目的片段（上面）的同时也“捕获”到非特异性片段（下面）。

②当Universal Blockers（作用：封闭接头序列，避免非特异性杂交）漏加/加入不足时,可能会造成文库接头未得到较好的封闭，从而它们之间也可能发生碱基互补配对，探针在捕获目的片段时同样“抓”到非特异性片段；

      注：图中A为Universal Blockers（绿色表示）封闭较好，未出现非特异性杂交；B表示由于文库片段中接头序列未得到较好的封闭，故在捕获到目的片段（中间）的同时也可能“捕获”到非特异性片段（左边&右边各一条）。

除了试剂的影响之外，熟练的实验操作也是避免非特异性杂交有效手段：

当杂交完成后需要进行目的片段的捕获以及后续的洗脱步骤。捕获是通过生物亲和素标记的探针与链霉亲和素标记的磁珠特异性结合，再利用固相磁力架吸附磁珠，从而得到目的片段。洗脱分为热洗脱和常温洗脱，在洗脱的过程中，目的片段与探针特异性结合不容易被洗掉，然而一些结合不紧密的非特异性杂交片段则被洗脱试剂清洗掉。所以熟练快速的捕获洗脱操作，既能避免引入杂质污染，也能减少非特异性杂交，也是下游高质量测序的保证。

2.小编在实践中也分享一些避免非特异性杂交的经验：

①确保杂交试剂加样准确无误；

②杂交过程中熟练的操作，在捕获&洗脱过程时，热洗脱过程尽量的快速，常温洗脱中间可适当涡旋震荡；

③维持良好的实验室环境，避免气溶胶等污染。

待续

小编后续会介绍文库构建过程中样本处理时片段化的方法选择和相关优缺点。