枸杞酵素:远离酒精性肝损伤

枸杞(Lycium barbarum),又称枸杞子、红耳坠 ,为茄科枸杞属,是一种 “药食同源”的植物性保健食品。现代医学研究充分表明,枸杞多糖、β-胡萝卜素、甜菜碱、牛磺酸、黄酮是枸杞中重要的有效活性成分,具有较强的生理活性、细胞保护作用和免疫活性作用,对抗肿瘤、保肝、降压、降血糖、抗衰老具有一定功效。

近年来,关于枸杞的研究主要集中在枸杞的深加工的工艺研究和抗氧化、抗炎和抗衰老等功效研究以及发酵过程中活性物质的变化等动态过程研究。目前,枸杞多糖能有效减轻化学毒素引起的坏死性炎症和氧化应激,作为一种食品补充剂在预防肝脏疾病方面具有很大的应用潜力。

酒精性肝损伤已经成为威胁人类健康和生命的一大疾病,预防和治疗酒精性肝损伤的重要机制主要为降低氧化应激、坏死性炎症和核转录因子活性从而实现肝脏损伤的保护作用,还涉及各途径介导的肠道菌群失调,肠屏障功能障碍等。

为使得枸杞的有效成分完全提取利用,除对其中有效成分如枸杞多糖,黄酮等提取加工成功能食品,利用生物技术发,成为一种成本较低且能广泛应用的深加工方式。通过控制微生物的生长,将枸杞中成分转化成具有健康益处的饮料。发酵能产生独特的风味、香气和质地,也可用于食品品质改良及风味提升。在加工生产中,乳酸菌被广泛使用,酵母菌MN0110自身能够产生SOD等具有强抗氧化性的物质,提高自由基的清除能力并缓解脂质氧化。

本研究采用乳杆菌MN1030,乳杆菌MN0727,乳杆菌MN0930和酵母菌MN0110对宁夏枸杞原浆进行液态发酵,通过ADH激活率和SOD酶活力优化各自的发酵工艺。对发酵后的枸杞酵素分别进行对HepG2细胞酒精性损伤模型的保护作用评价。以期选择能够增强枸杞酵素解酒护肝功效的的菌种,为开发保护酒精性肝损伤的功能性食品提供基本依据。

发酵工艺的条件优化

接菌量

在一定范围内,不同的接菌量影响发酵酵素的产酸的速度,在一定范围的pH下,菌种的生长又能受到pH的影响。此外,接种量的增多能够缩短发酵时间或缩短延滞期。如图1,随着酵母菌MN0110接菌量的增加,ADH激活率逐渐增大SOD酶活力缓慢上升后趋于不变,在5%时达到最大。乳杆菌MN0727随着接菌量的增加,在5%接种量下ADH激活率达到最大,但SOD酶活力却相对较小,选则3%作为接菌量。乳杆菌MN1030和乳杆菌MN0930变化趋势一致,SOD酶活力分别于5%,3%时达到最大。综合以上,乳杆菌MN0727、乳杆菌MN0930最优接菌量为3%,酵母菌MN0110、乳杆菌MN103最优接菌量为5%。

图1接菌量对ADH激活率和SOD酶活力的影响

发酵温度

为了探究温度对不同菌种发酵枸杞酵素产生的影响,设置了不同温度作为发酵条件。菌种在发酵过程中温度过低或过高,菌种生长缓慢,ADH激活率和SOD酶活力降低。因此,选择了37℃作为乳杆菌MN0727和乳杆菌MN1030的最终发酵温度,29℃作为酵母菌MN0110的发酵温度,41℃作为乳杆菌MN0930的最终发酵温度。

图2 发酵温度对ADH激活率和SOD酶活力的影响

发酵时间

由图3可知,不同种类的菌种对于ADH激活率和SOD酶活力的影响各不相同,主要是由于菌种的不同特性决定的。4种菌种除乳杆菌MN1030发酵枸杞酵素在ADH的激活率呈现先上升后下降的趋势。随着发酵时间的延长,SOD酶活均呈现先缓慢升高后下降的趋势。因此,乳杆菌MN0727枸杞酵素和枸杞酵素的最佳发酵时间为36h,乳杆菌MN1030的最优发酵时间为48h,乳杆菌MN0930的最优发酵时间为24h。

图3 发酵时间对ADH激活率和SOD酶活力的影响

HepG2 肝癌细胞上验证酒精性肝损伤的保护作用

MTT筛选造模浓度和给药浓度

用HepG2细胞为模型细胞,用酒精为损伤诱导剂,构建HepG2细胞酒精性损伤模型。利用MTT法检测发现,如图4所示,随着浓度的上升,细胞的存活率逐渐下降,在700mmol/L时达到IC50。选取500,600,700mmol/L浓度测定LDH泄露率。当酒精浓度为600mmol/L左右时,细胞存活率在50%左右,超过半数致死率,说明造模的酒精浓度给细胞造成损伤但又不至于造成细胞全部死亡,对应的浓度为建立HepG2细胞酒精性损伤模型的最佳损伤浓度。

未做任何处理的细胞对照组的LDH泄露率为100%,此时,不同的造模浓度的泄露量分别为127.80%,153.21%,152.77%。酶的泄露量在600mmol/L和700 mmol/L相差不多,由于后面继续添加给药组,时间增加24h,可能也会给细胞带来损伤。因此,将HepG2细胞酒精性损伤模型的造模酒精浓度设置为600mmol/L。

图4 酒精性肝损伤造模条件

给药浓度

由图5可知,原浆和4个不同菌种枸杞酵素处理组在400μg/mL浓度以内,HepG2细胞存活率均在90%以上,不显示毒性作用,且各样品组的细胞存活率相近,说明试验所选各样品浓度均不会影响HepG2细胞的正常生长,因此将400μg/mL作为后续的实验浓度。

图5 不同菌种发酵枸杞酵素预处理对HepG2细胞存活率的影响

ADH

由图6可知,乳杆菌MN1030发酵枸杞酵素,酵母菌MN0110均可显著提高受损细胞中的ADH活力(p<0.01)。ADH的酶活性在酒精处理后会由于细胞损伤和酒精代谢而增加。酵素组处理后,HepG2细胞中ADH活性升高,说明增强了酒精的代谢,防止乙醛积聚来迅速缓解乙醇诱导的HepG2细胞损伤。

图6 不同菌种发酵枸杞酵素预处理对酒精性肝损伤HepG2细胞中ADH活力的影响

对HepG2细胞AST和ALT的分泌量的影响

通过酒精性损伤细胞,AST,和ALT的释放量能够反应肝细胞的受损程度。炎症和ROS的产生会导致细胞外的AST和ALT含量产生变化,细胞损伤程度轻,胞内的ALT和部分AST逸出,细胞损伤程度重,线粒体内的AST逸出。酒精的处理可能导致细胞膜和线粒体损伤,AST和ALT被释放到细胞外。与模型组相比,乳杆菌MN0930发酵处理组和原浆处理组的细胞外AST含量具有一定的下降,但是没有明显的差异(P>0.05)。乳杆菌MN0727、酵母菌MN0110、乳杆菌MN1030组均显著降低了细胞外的AST的含量(P<0.05)。与对照组相比,模型组ALT的含量显著升高。较模型组,不同剂量组可显著降低受损干细胞的ALT的分泌量。乳杆菌MN1030与模型组差异显著(P<0.01),且与对照组水平相近。说明乳杆菌MN1030酵素组对酒精性肝损伤有较好的干预作用。

图7 不同菌种发酵枸杞酵素预处理对酒精性肝损伤HepG2细胞中AST和ALT的影响

MDA

MDA 作为生物体脂质过氧化的标志物,主要是由于炎症因子以及ROS等造成细胞内的氧化机制遭受到破坏,引起细胞膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化。如图8所示,与对照组相比,模型组的MDA生成量显著升高(P<0.01),是对照组的2.94倍。不同菌种发酵枸杞酵素单独作用于细胞,均可显著降低受损肝细胞内MDA的产生量,却不能恢复至细胞的最初水平。对照组的MDA产生量在2.30μmol/g prot,作用效果最好的酵母菌MN0110和乳杆菌MN1030能将造模组6.77μmol/g prot分别恢复至2.46和3.81μmol/g prot。MDA的显著降低说明乳杆菌MN0727和酵母菌MN0110发酵对保护细胞免受脂质过氧化的能力要高于其他处理组。

图8 不同菌种发酵枸杞酵素预处理对酒精性肝损伤HepG2细胞中MDA的影响

SOD

SOD是细胞内抵抗氧化应激的主要酶系之一,是SOD,CAT,GSH-Px抗氧化酶系中最重要的一种酶。图9显示,模型组较对照组的SOD酶活显著降低(P<0.01),细胞内的抗氧化机制已经失衡,细胞已处于氧化损伤状态。酵素处理组较模型组SOD酶活均有不同程度的升高,表明酵素处理组能抵御酒精诱导的氧化应激损伤,通过过量表达SOD酶来恢复HepG2细胞的氧化应激机制。其中酵母菌MN0110发酵处理组的SOD酶活最高,乳杆菌MN1030、乳杆菌MN0930次之、原浆和乳杆菌MN0727最弱。与对照组差异显著(P<0.01),说明酵素处理并不能完全抵御酒精造成的细胞损伤,但在一定程度上具有保护作用。

图9不同菌种发酵枸杞酵素预处理对酒精性肝损伤HepG2细胞中SOD抗氧化酶活的影响

结论

发酵主要从菌种的选择和工艺的优化来提高发酵食品的功能特性。

本实验将乳杆菌MN1030、酵母菌MN0110、乳杆菌MN0727、乳杆菌MN0930接种枸杞原浆进行发酵,通过对发酵的条件(接菌量,时间,温度)进行优化,确定具有潜在护肝功能的枸杞酵素的最优发酵条件。使用最优发酵条件下不同菌种发酵的枸杞酵素作用细胞,能显著降低造模组的MDA的产生,AST和ALT的分泌量,显著增加SOD酶活力和ADH的激活率。结果表明,处理组对损伤细胞均具有保护作用,其中酵母菌MN0110和乳杆菌MN1030的保护作用最为显著(P<0.01),未发酵原浆对损伤细胞有保护作用,但是效果不显著(P>0.05)。酵母菌MN0110和乳杆菌MN1030发酵的枸杞酵素可从氧化应激、脂质代谢方面对缓解酒精性肝损伤具有一定功效。

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