HUD结合和调控来自神经元发育和突触可塑性相关基因的环状RNAs
论文：HuD Binds to and Regulates Circular RNAs Derived From Neuronal Development- and Synaptic Plasticity-Associated Genes（HUD结合和调控来自神经元发育和突触可塑性相关基因的环状RNAs）
摘要
RNA结合蛋白(RBP)HUD参与神经元的分化、再生、突触可塑性和学习记忆.RBPs不仅与mRNAs结合，而且还与多种RNA相互作用，包括环状RNA(CircRNAs)，一类由预mRNA反向剪接产生的非编码RNA。
本研究探讨HUD是否能调节神经元圆环RNA的表达。HUD通过与腺苷酸-UridyateRichElement(ARES)结合来控制靶RNA的命运.通过生物信息学分析，我们发现在约26%的脑表达转录因子中存在HUD结合基序.通过小鼠纹状体RNA免疫共沉淀(RIP)和圆环RNA阵列，我们鉴定了600多个与HUD结合的圆环RNA。
在这些基因中，226条来自hud还与其相关的mRNAs结合的基因，包括圆环，这是我们以前描述的突触HUD靶基因crcRNA。HUD与另外两个可塑性相关的圆环RNA的结合，圆克里布1，和圆环Ufp 2，用圆环RNA特异性qRT-PCR进行验证。
有趣的是，我们发现环Upf 2也在突触体中富集。通路分析证实，大多数HUD结合的圆环RNA来源于调控神经系统发育和功能的基因。利用HUD高表达(HUD-OE)小鼠和敲除(KO)小鼠的纹状体组织进行crcRNA表达分析，鉴定出86株HUD调控的cRNA。
这些基因来源于与HUD RIP相同的生物通路中的基因。对HUD调控和HUD结合的cRNA进行相关分析，发现在HUD-OE或HUD-KO中分别有69条和5条。这些包括圆Brwd 1, 圆周Foxp 1，和CircMap1a来源于神经元发育和再生的基因，以及环Magi 1和圆环Lppr4，起源于控制突触形成的基因，并与精神疾病有关。
这些圆环RNA形成相互竞争的内源性RNA(CerNA)网络，包括microRNAs和mRNAs。在HUD靶基因中，圆Brwd 1和圆周Foxp 1是以与其各自的mRNAs相反的方式调控的。其他与发育和可塑性相关的hud靶基因的表达，如CircSatb 2，CirHmer1a和环Ntrk 3在可卡因条件性位置偏爱(CPP)建立后也发生了改变。
综上所述，这些数据表明HUD与圆环RNA的相互作用调节了它们的表达和转运，由此产生的HUD调控的CerNA网络的改变可以控制神经元的分化和突触可塑性。
HUD与调控神经系统发育和功能的基因ccRNA结合
HUD结合模体在小鼠脑圆环RNA中的高频率表达。
(A)38.7%的MMU_CircRNA在大脑中表达，其中31%在中脑，48.57%在前脑，20.44%在后脑。
(B)小鼠圆环RNA的生物信息学分析显示ARE序列的分布。对来自圆环碱基的完整注释的MMU_cRNA序列进行了分析，发现有33%的序列具有HUD一致结合基序和其他基序。这组圆环RNA的饼图显示，每个基序中含有29.11%的HUD特异基序(14.20%motif 1；8.58%motif 2，6.33%motif 3)。
(C)火山图表示HUD RIP与WT控件(粉红色矩形)中圆环RNA的差异富集。HUD免疫共沉淀后获得的RNA按“材料和方法”一节所述进行圆环RNA阵列分析。垂直线分别对应上下1.5倍的变化，而水平线代表一个p-价值0.05，n每个IP=3(HUD-OE、WT和IgG)，每组3只小鼠，用三种不同的RIP方法进行组织分析。红色数据点代表差异表达的圆环RNA。
HUD在体内与CircUpf 2和CircCreb 1结合。
(A)HUD与来自Upf 2和Creb 1基因的圆环RNA之间的相互作用被HUD RIP和WT对照RIP所证实，然后再用圆环RNA特异性的qRT-PCR检测。值表示为折叠变化与IgG对照。以MMU_CIRC_cis-R7为阴性对照。数据采用单因素方差分析，随后采用邓恩多重比较检验，表示为均值±扫描电镜；*p < 0.05, n = 3.
(B)用RNase R对crcRNAs的特异性扩增进行验证，用RNase R对所有线性RNA进行预处理，随机引物与寡突T对寡突T扩增crcRNAs和mRNAs。n = 3.
(C)从小鼠纹状体突触体提取液中提取的总RNA按“材料和方法”部分所述进行加工，并对crcUpf 2和CircCreb 1进行qrt-PCR。值标准化为GAPDH mRNA水平，表达为折叠变化与WT对照；S1、S2和突触体分数(SYN)之间的BC1 RNA水平差异用于验证突触小体(SYN)的纯化，如前面所述(Rao和Steward，1991年)。学生数据分析t-测试(CircUpf 2和CircCreb 1)和单向方差分析(BC1)。值表示平均值±扫描电镜；*p < 0.05, n = 3.
UD靶基因表达途径及功能分析。RIP鉴定的HUD相互作用圆环RNA的独创性途径分析。
(A)与HUD结合基因相关的顶级分子功能。
(B)顶级疾病和功能。
(c、D)具有代表性的网络，包括编码谷氨酸能传递蛋白的基因的圆环RNA。
(C)和表观遗传调节剂(D).
讨论
物质使用障碍(SUDS)中的强迫性药物寻求行为被认为是由药物在反复暴露后诱发分子、细胞和电路水平的适应性失调所介导的。包括HUD在内的几个RBP与成瘾相关的途径相关。HUD本身被列在与成瘾相关的基因知识库(KARG)中，进一步表明它在吸毒成瘾中的作用。
此外，在可卡因CPP过程中，HUD及其靶mRNA不仅在NAC中增加，而且HUD-OE小鼠与野生型小白蚁相比，可卡因CPP增加。使用可卡因CPP后，我们发现调控上下文调节、认知、学习和记忆的基因的圆环RNA发生了显著的变化。
其中包括RIP鉴定的几个HUD靶基因，以及一些预测的目标。其中之一是圆卫星2，该基因来源于与染色质可达性调节因子sabb 2相同的基因，该基因参与海马依赖的长期记忆和可卡因调节。另一个在CPP期间改变水平的HUD靶基因圆环RNA是圆环，这与海马的稳态可塑性有关。
这种圆环RNA来源于编码Hmer 1的基因，这是一种与谷氨酸能突触相关的蛋白，与药物成瘾有关。突触可塑性是网络动力学变化的基础，被认为是学习和记忆的基础。因此，cpp后水平显著升高或下降的顶端基因参与神经元迁移、突起和树枝状突起的生长和分支，这也就不足为奇了。