3小时药敏检测，让抗生素精准狙击细菌
抗生素能救命，但抗生素滥用带来的超级细菌耐药也能致命。世卫组织专家估计，到2050年，由于细菌对抗生素耐药导致的死亡人数可能从目前估计的每年70万人增加到每年1000万人，世界生产总值的损失将达到100万亿美元。
科研人员在拉曼检测板上滴加氘标记后的尿液细菌标本
近日，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（以下简称苏州医工所）联合复旦大学附属华山医院、英国牛津大学的科研团队，开发了一种适用于血液和尿液标本的快速药敏检测方法（FRAST），相关研究成果发表于《分析化学》。
论文第一作者、苏州医工所研究员宋一之告诉《中国科学报》：“FRAST将尿液和血液标本的药敏检测时间由3～4天分别缩短为3小时和21小时，有望让抗生素精准狙击细菌。”
不够快、不够准
“药敏检测如果能在获得标本当天完成，是最理想的。”论文作者之一、复旦大学附属华山医院主任医师徐晓刚向《中国科学报》解释道，“只有拿到药敏报告后，才可以实现精准用药。”
药敏定量试验中的MIC（minimum inhibitory concentration）值，即在体外抑制细菌生长的最低药物浓度，一直是微生物药敏试验、抗菌药效评价和临床抗菌方案制定的主流标准与主要依据之一。
徐晓刚介绍说，普通细菌的培养至少需要一天时间，厌氧菌可能需要72个小时，之后再做药敏试验还需要大概20个小时。粗略计算下来，3～4天对药敏检测来说是一个必要时间。
由于尿液细菌含量相对血液来说要多，节约了细菌培养的时间，使尿液药敏检测比血液药敏检测用时短，但还是无法在一个工作日内完成。现在的药敏检测流程不仅耗时耗力，并且对体外生长缓慢的病菌无能为力。
研究人员还发现，MIC只能从抑制细胞数目扩增这一角度反映与测量药效，却无法检测处于NGMA（Non-Growing but Metabolically Active）状态的病菌，即在药物作用下已经不再增殖但仍然具备代谢活性的存活细胞。如果在抗菌治疗中成为漏网之鱼，将贻误病情，引起复发性感染。
徐晓刚在临床中发现，这种状态的病菌也是十分常见的，带来的结果就是在治疗感染类疾病时，存在滥用和过度使用抗生素的情况，进而诱导耐药菌乃至“超级细菌”的频繁出现。
不够快、不够准，已经成为传统方法制定抗菌治疗方案中不可避免的现状。快速检测感染细菌的药敏特性，对确保有效抗生素的使用和减少对广谱药物的需求起着关键作用。那么如何准确且快速的判断感染细菌的药敏特性呢？
为什么用拉曼光谱
1928年，印度科学家拉曼在实验室发现，单色入射光透射到物质中的散射光包含与入射光频率不同的光，即拉曼散射。拉曼也因此获得诺贝尔奖。
近年来，英国牛津大学副教授黄巍一直利用拉曼光谱进行单细胞的研究工作，同时也开发了拉曼与稳定同位素标记联用技术，是一位将拉曼引入单细胞分析中先行者。
细菌大多是单细胞。黄巍在采访中提及，单细胞拉曼图谱最大的特点就是无需外源标记，展现的是细胞的内在信号，可以视为细胞的化学指纹或者化学画像，又称为细胞的表型，是基因和环境互相作用的结果。
宋一之曾师从于黄巍学习拉曼光谱技术，通过学术交流活动，他们与华山医院抗生素研究所所长王明贵和徐晓刚相识。在两位同时具有临床和科研经验的医生介绍临床药敏检测的困局之后，宋一之和黄巍立刻启动了单细胞拉曼光谱—重水标记联用技术对耐药菌的检测研究。
为什么选择该项技术？宋一之向《中国科学报》介绍道，单细胞拉曼图谱可以看作一个细胞所有分子拉曼光谱指纹的总和，而细胞代谢的变化或者其他内在差异都会引起细胞表型的变化，并继而反映在细胞拉曼光谱信息中。
研究发现，具有代谢活性的细菌在重水（氘代水）环境中会将氘元素整合进细胞内，这一过程称为氘标记。氘标记后的细菌的拉曼光谱中产生新的碳—氘特征峰，成为了单细胞水平细菌代谢活动的生物标记物。
宋一之说：“在抗生素作用下，易感菌代谢活性会受到抑制，而耐药菌则不受影响并产生明显的碳—氘峰，这一过程不依赖于细菌的增殖，对样品中细菌的数量要求也很低。因此通过单细胞拉曼光谱检测细胞活性，可以克服临床微生物试验对长时间培养的要求，使快速药敏成为可能。”这就是基于拉曼光谱—重水标记联用技术的FRAST方法。
“从样本到报告”的快速诊断
据悉，拉曼光谱—重水标记联用技术可以直接作用于单细胞而无需培养，并在几分钟内鉴定病原微生物种类，通过标记后（1～2小时）的拉曼特征峰，判定感染细菌的代谢活性，快速筛选有效抗生素种类。
以尿液感染标本检测为例，宋一之介绍了FRAST方法：“首先通过离心收集尿液中的细菌，之后在共聚焦显微拉曼系统下，对细菌观察并进行拉曼指纹图谱的采集，这一过程可判断尿液中是否有菌及菌量。”
研究人员将采集到的拉曼光谱利用机器学习模型，与已经建立的革兰氏阴性菌和阳性菌的拉曼光谱数据库进行比对，预测样品中细菌的革兰氏阴阳性，并以此选择合适的药敏板。在重水环境中与不同种类和不同浓度的抗生素作用1～2小时后，细菌的拉曼光谱再次被采集，并通过算法分析其碳—氘峰强度特征。
试验过程中，研究人员对包含质控菌株和血液与尿液原始标本在内的超过3000个样本，采集了6万余张单细胞拉曼光谱，并与临床金标准（微量肉汤稀释法或临床自动药敏系统）进行了对比，结果显示，FRAST方法对革兰氏染色结果的预测准确率为100%，药敏结果与金标准总体一致率大于88%。
“这是迄今为止拉曼—重水标记联用技术在病原菌药敏检测中最完整的研究数据集，因此对于该技术的临床应用具有重要的指导作用。”宋一之表示，基于拉曼的革兰氏染色预测方法的整合，使得FRAST成为相对独立完整的测试方法，临床医生可以无需其他手段辅助，完成“从样本到报告”的快速诊断。
该方法的优势在于，在显微拉曼系统下，仅需几十个细胞就可以获得有代表性的结果；氘标记不依赖细菌的生长，因此可以有效缩短时间。另外，与近年来发展较快的耐药基因的分子诊断技术相比，FRAST药敏是基于抗生素对细菌作用的表型，因此该结果不会因未知的耐药机制或基因表达调控影响而产生对药敏的误判。
宋一之告诉《中国科学报》：“目前，临床微生物检验流程中使用的技术多数由国外研究团队和公司提出并开发，FRAST等新技术的出现将有助于我国科研和医务工作者实现弯道超车，在病原菌感染快速诊断技术与装备方面形成原创技术与核心竞争力。”
他也指出该方法在技术层面存在的困难——快速检测拉曼信号。“由于拉曼信号本身较弱，细菌个体比较小，如何快速、高灵敏地检测到检测信号是一个挑战。”未来，宋一之等研究者希望借助拉曼信号增强技术和自动化手段，进一步缩短时间、提升灵敏度，使其能更早的用于人类与病原菌的战争中。（沈春蕾）