科研 | Nucleic Acids Research：保守的序列签名对于稳定的植物miRNA生物发生至关重要
编译：Nicole，编辑：十九、江舜尧。
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miRNA是20-22nt的非编码RNA，在生物学过程中参与对靶标的转录后沉默。植物通过Dicer-like（DCL）1蛋白从具有特定茎环结构的长Pol II转录物中加工形成miRNA。尽管有报道表明如何选择特定区域合成miRNA，但其细节尚不清楚。本论文显示了精确的miRNA合成需要miRNA/miRNA*区域内存在特定的富含GC的特征序列。通过详细的分子和功能分析，证实富含GC的标记序列参与miRNA的精确加工和丰度的富集。与miRNA特异性GC标记一致，miRNA调控的靶标RNA在其miRNA结合基序中也具有保守的互补序列。这些GC特征序列的选择取决于DCL1的RNA结合蛋白伴侣HYL1。同时论文证明了该发现在增强植物功能基因组miRNA研究中的具有重要的应用价值。
论文ID
原名：A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis
译名：保守的序列签名对于稳定的植物miRNA生物发生至关重要
期刊：Nucleic Acids Research
IF：11.147（1区）
发表时间：2020.1.29
通讯作者：Padubidri V. Shivaprasad
通讯作者单位：印度塔塔基础研究所国家生物科学中心
DOI号：10.1093/nar/gkaa077
实验设计
从miRBase（21版）获得所有成熟miRNA和miRNA前体（包括来自植物、动物的前体），对其保守序列分析，自定义python脚本用于计算GC含量，并使用R和/或Python绘制图。进一步从PNRD（植物非编码RNA数据库）下载拟南芥和水稻等植物miRNA，计算核苷酸的相对频率和沿序列长度的GC含量。用于GC富集的比较；使用来自双子叶植物和单子叶植物的所有保守miRNA检查碱基位置特异性。使用可公开获得的sRNA数据集来查找与isoomiRs和sib-miRs比较的成熟miRNA的丰度。
拟南芥的初级miRNA序列是从mirEX数据库获得的，从文献中筛选出拟南芥miRNA的已知靶标，并从TAIR数据库获得其序列。靶序列和miRNA序列通过psRNATarget软件确定靶位置。利用拟南芥降解组数据分析了miRNA靶向的RNA是否具有GC标记以保持与miRNA的互补性。
农杆菌浸染转化本氏烟草瞬时表达miRNA及其突变体。为了避免转录偏差，利用CaMV35S启动子表达除了miRNA/miRNA*区域外具有相同序列的4个茎环结构。从农杆菌浸润组织中提取RNA并测序获得sRNA数据，利用RNA印迹分析的结果。为了验证进一步使用单子叶植物特异的miR528和水稻miR2871对其进行突变，分析GC含量及特征序列的作用。在3个不同的温度下进行了试验，将miRNA及其衍生物表达在低温（15℃）、最佳温度（23℃）和高温（32℃）下生长的植物。RNA印记分析其表达验证温度对识别是否具有作用。
利用miRNA反义沉默NtHYL1，验证其在miRNA特异性GC与HYL1蛋白的识别作用。为了检测HYL1是否具有与前体中特定的含GC结构结合的特异性，使用了三种不同的HYL1：全长（GST-AtHYL1-6×His）、具有两个RBD的dsRBD12（6×His dsRBD12）和单独的dsRBD1进行了凝胶阻滞分析（EMSA）。
为了验证GC特征序列的应用价值，通过WMD3在线工具，生成了针对葡萄MYBA7和GFP的候选amiR，通过RT-PCR验证靶向RNA的沉默效率，并结合花青素及GFP荧光表型，分析GC标记在amiR技术改进中的应用潜力。
结果
植物miRNA之间保守的GC富集
为了证明结构和/或序列决定簇可能有助于选择Pre-miRNA中的特定区域进行处理，将miRBase（21版）中的所有miRNA条目进行了跨miRNA前体（包括来自动物的前体）的保守序列分析，发现植物miRNA在其miRNA/miRNA*区域中具有比其前体更高的GC。进一步选择了拟南芥和水稻，用于GC富集的比较。结果显示拟南芥和水稻中只有tRNA和miRNA比平均mRNA具有更高的GC含量。有趣的是，这种GC的偏向性仅限于两种植物中保守且高表达的miRNA（图1A）。结果表明对于类似于tRNA的miRNA GC含量更高的进化选择。同时发现miRNA/miRNA*双链体区域的GC高于茎环（图1B）。然而，在单子叶植物中，与其他前体相比，miRNA区域的GC含量没有显着增加或减少（图1B）。双子叶植物和单子叶植物中保守性较低的miRNA具有比茎环区域更高的GC含量。
为了验证成熟miRNA/miRNA*区域的首选GC含量，使用了可公开获得的sRNA数据集来查找与isoomiRs和sib-miRs比较的成熟miRNA的丰度。结果表明，对于所有在植物中大量表达的miRNA，GC含量约为50％。
miRNA特定且可变的GC签名
为了了解miRNA中GC偏向性的基础，使用了来自双子叶植物和单子叶植物的所有保守miRNA条目，并检查了位置特异性。如预期的那样，大多数miRNA的5末端都有U偏向。但是，与相邻序列相比还观察到了一些口袋中G或C的偏向性，例如位置2-4、8-9以及位置18-19和21（图1C和D）。在某些位置，尤其是在双子叶植物之间，存在明显的AU偏向性，例如在5、7、15和17位。双子叶植物和单子叶植物miRNA中保留了特定于位置的GC偏向性（图1C和D）。
进一步验证了在其他类别的丰富sRNA（例如siRNA）之间是否共有特定的特征序列。在miRNA以外的大量21 nt、22 nt和24 nt reads中未观察到GC偏好，证实了GC偏向性与sRNA长度无关。在大多数植物中，24-nt siRNA（尤其是源自转座子的siRNA）的积累水平高于miRNA。在高丰度的24-nt reads和高特异性的24-nt reads中，除了众所周知的腺嘌呤（A）的5_-nt偏向性外，均未观察到任何位置的偏倚（图1E和F）。24 nt的reads对A或U有强烈的偏好，因为此类24 nt RNA的来源是富含AU的转座子和重复序列。相应地，转座子和转基因来源的siRNA不能靶向富含GC的编码序列。同样，在称为tasiRNA的21 nt阶段性次级siRNA中，任何位置都没有偏差。
为了支持上述观察结果，将来自拟南芥的保守且高丰度的miRNA与GC的位置进行特异性相匹配（图1G）。序列具有互补性的miRNA，具有2 nt移位的GC特征序列（图1G）。此外，该特征序列独立于miRNA加工机制，因为这两组中的miRNA显示出几乎相同的预测GC特征序列。在所有miRNA中，仅在miRNA/miRNA*区中观察到GC含量较高和GC特征序列。这些结果表明在miRNA的许多位置都对G或C有特定的偏好，因此可以保持平均GC含量。在其他种类的丰富sRNA中未观察到这种偏好。
图1.植物成熟的miRNA具有独特的GC含量和特征。 （A）表示保守和不保守miRNA的miRNA前体和成熟miRNA区域的GC含量的框线图（双子基因组20个；单子叶植物基因组14个；双子叶植物保守前体2335个，miRNAs 2722个；单子叶植物保守前体691个，miRNA 1005个；双子叶植物保守度较低的前体2471个，miRNA 2862；单子叶植物保守度较低的前体 925个，miRNA 1191个）。（B）来自单子叶植物和双子叶植物的miRNA前体的不同片段中的GC含量（双子叶植物769个；单子叶植物557个）。（C–F）沿着保守的独特双子叶植物miRNA的长度的位置特定百分比的核苷酸丰度（672个），（C）保守的独特单子叶植物miRNA（263个），（D）双子叶植物的24-nt序列（546375个），（E）单子叶植物的24 nt序列（265546个）（F），（G）矩阵显示跨miRNA的可变的GC标志序列（5至3）。使用了拟南芥的非冗余保守21-nt miRNA和保守miRNA的miRNA*。颜色代表每个位置的GC比率。
目标mRNA在miRNA结合位点具有互补的GC标记
植物miRNA需要与其目标RNA更高程度的互补性才能有效靶向。本研究利用拟南芥降解组数据分析了miRNA靶向的RNA是否具有GC标记以保持与miRNA的互补性。在所有这些mRNA和非编码RNA的靶区域中，观察到了与miRNA的GC标记相匹配的互补GC偏好（图2A）。在与miRNA特征序列匹配的所有mRNA位置中，目标RNA中的GC偏向都非常特异，除了在miRNA的12位（或靶标的互补位置10）中，靶RNA具有较高的GC偏向性，与miRNA特征序列不互补（图2A）。目标RNA的相邻区域没有序列特征序列，这表明mRNA仅在目标区域与miRNA特征序列互补。
进一步观察到除了miRNA靶向的RNA基序以外GC和AU跨RNA均匀分布（图2B和C）。使用拟南芥或水稻的保守miRNA的所有预测靶标时，观察到了相同的趋势（图2D）。通常，miRNA延伸区和其靶向的mRNA的延伸区都在21 nt处显示GC特征序列，并且该特征序列彼此互补（图2E和F）。
图2. mRNA中的miRNA靶位点与miRNA GC特征序列互补。（A）miRNA靶区域的位置特异性GC比/平均cDNA GC含量（85个，非冗余靶序列）。（B）通过实验验证的拟南芥保守miRNA靶序列中的GC含量。（C）目标位置前后3个连续21 n的GC百分比。（D）psRNA-Target工具预测的拟南芥miRNA靶代表基因模型序列中的GC含量（e值截止为4，3379个）。（E）30-nt中跨前体的保守miRNA的位置特异性GC特征序列（来自拟南芥的353个独特miRNA）。（F）在miRNA靶区域（92个独特靶）中的位置特异性GC特征序列。
具有不同GC含量的人工RNA底物经过差异处理
GC偏差的存在表明DCL1可能更喜欢这种特征序列。如果DCL1复合物介导了这种偏向性，则具有GC标记的miRNA样底物可能更适合加工。本研究在烟草中瞬时表达保守的miRNA，通过替换不同的GC含量的序列来验证miRNA中保守GC标记的存在。为了避免转录偏差，利用CaMV35S启动子表达除了miRNA/miRNA*区域外具有相同序列的4个茎环结构（图3A）。结果显示GC占52％的miRNA以21-nt的形式达到很高的表达水平（图3B）。同样具有52％GC但GC仅偏向成熟miRNA区域一端的结构会积聚低水平的sRNA，包括非标准大小的sRNA。另外，GC含量为28％和71％的miRNA表达可以忽略不计。
从农杆菌浸润组织中获得sRNA数据集（图3C），以了解这种偏倚的性质并确认RNA印迹分析的结果。发现跨越所有4个茎-环区域的reads丰富度低，表明RNA前体确实在烟草中表达。Northern分析也表明在sRNA数据集中有大量52％GC的miRNA积累（图3C和D），大多数匹配52％GC茎的 reads长度为21nt，并且近60％的此类 reads具有特征序列GC（图3D）。这些观察结果证实了在宿主miRNA中存在GC特征序列，宿主miRNA专门处理DCL1复合体以产生大量miRNA。
图3.体内miRNA前体的高效GC含量特异性处理。 （A）具有4个茎环的人工前体的2D示意图，每个茎环具有所示GC含量不同的独特成熟序列。突出显示的区域代表miRNA/miRNA*区域。 AU标记为蓝色，GC标记为红色。该构建体在CaMV 35S启动子下表达。（B）本氏烟草中具有不同GC含量的miRNA的Northern分析。 （C）表达人工前体4dpi的烟草叶片sRNA测序。4个大的棕色箭头指示串联的4个茎环。粉色、红色、绿色和蓝色分别代表20、21、22和24-nt reads。箭头的粗细表示丰度。 （D）比较定位于人工前体的sRNA的丰度。蓝色（所有 reads为21–24-nt），红色（21-nt），绿色（GC含量在40％至60％之间的 reads），黄色（GC含量在40％至60％之间的 reads以及GC特征序列）条表示丰度。
GC含量和GC特征序列均在miRNA加工中起作用
为了了解这些功能重要性的层次结构，本研究使用了具有GC特征序列的单子叶植物特异的miR528（图4A）及其在烟草中的表达形式（图4B）。miR528在表达它的所有植物（包括水稻）中都经过精确加工（图4A）。miR528前体的所有衍生物均具有与miR528相似的预测二级结构。结果显示在对照烟草样品中未积累可检测水平的miR528（图4C）。成熟的miR528具有较高的GC含量（62%），突变2个位置后（m1）将miR528 GC含量降低至52％，突变后积累的水平略低（图4B）。与WT miR528相比，miR528-m1的7和10位具有A或U，以匹配最佳GC特征序列。这表明GC含量和特征序列至少对于miR528重要。其他没有特征序列的GC含量也为52％的miR528突变，表达水平和m1一样，但加工不正确从而产生较短的sRNA，例如m4（图4C）。另一方面，具有低GC和极少GC特征的转录本几乎无法检测到（m2和m3，图4C）。
为了进一步阐明GC特征序列的作用，试验引入了具有相同GC含量但对G或C具有不同位置偏向性的其他突变体（图4B和D）。结果显示位置8和9以及位置18和19的GC特征序列对于这些miRNA的大量加工是绝对必需的。例如，在m7中其中位置8和9以及位置18和19具有G或C，但在5_端具有AU富集序列仍产生大量加工的sRNA，表明这些位置的GC是比2至4位的GC更重要（图4C和D）。在m10（在2-3、8-9、18-19和21位的GC特征序列保持完整，而整体GC降低到33％）的累积量非常低。即使在GC含量相似的情况下，如m2（33％GC，无特征序列）和m10（33％GC，有特征序列）比较，GC特征序列也会增加其积累。
为了检查在低丰度的miRNA是否会有星型miRNA不成比例的积累，研究检测了miRNA*（3p）序列。在m2、m3和m9的较小突变体中，星型序列的积累水平略高，但仍然非常低，这表明链选择不是造成GC特征序列信号丰度较高的主要原因。miR528-m10的5p丰度较低，也不会累积3p（图4C和D）。这些结果表明，GC含量和GC特征序列均在miRNA生物发生及其积累中起作用。据此得出结论，位置8–9、18–19的GC和位置5、7、10和15的AU是有效处理所需的最小特征，位置2–4、6和21的GC参与有效处理但作用不重要。
水稻中另一个保守性较低的miRNA miR2871，通常以较低的水平表达，但在各种非生物胁迫中被诱导。但这种miRNA的GC含量较低（28％）。研究创制的更高的GC含量的衍生物，其中包括具有最佳GC含量和特征的突变体（m2，图4E）。结果显示mR2871-m2的GC含量为52％，在2-4、6、8-9、18-19具有G或C标签，在5、7和10位A或U标记，产生了大量加工的miRNA（图4F）。与WT miR2871相比，在m2的积累至少高出10倍。m2的miRNA *（3p）序列的积累很高，并且与miRNA（5p）的水平成比例。这些结果表明，GC标记有助于富集miRNA/miRNA *双链体的生物合成。
众所周知，sRNA尤其是miRNA的合成和积累是温度依赖性的。为了评估GC特征序列的要求是否还取决于最佳温度，在3个不同的温度下进行了试验，将上述miRNA及其衍生物表达在低温（15℃）、最佳温度（23℃）和高温（32℃）下生长的植物。结果与最佳温度23ºC相比，miRNA在15和32ºC时低水平积累，并且选择最佳GC的趋势在所有测试温度下均保持不变，这表明基于GC特征序列的选择对miRNA合成的影响与温度无关（图4G）。
GC特征序列与HYL1优先绑定相关
HYL1 dsRNA结合域1（dsRBD1）中的特定残基对于底物结合必不可少。hyl1突变后DCL1的合成能力受到损害，导致低丰度的sib-miRs从前体中随机切隔。推测HYL1可能在整个前体中选择特征序列的候选物，导致DCL1可以准确地产生独特的miRNA/miRNA*序列。为了验证这一推测本研究利用miRNA以反义沉默了NtHYL1（图5A）。在amiR靶向品系和反义沉默品系中，HYL1 mRNA的水平降低，证实了内源性HYL1的靶向性。将具有4个茎环结构的前体（图3A）注入这些植物的叶片中，并分析了GC％有所不同的miRNA的差异加工（图5B）。如先前观察到的结果一致，miRNA在GC含量为52％时具有较高的积累，但是，在HYL1沉默的叶片中，该miRNA的积累减少了5倍以上（图5B）。这些结果表明，在体外和体内具有最佳GC的miRNA处理都需要HYL1。
为了检测HYL1是否具有与前体中特定的含GC结构结合的特异性，使用了三种不同的HYL1：全长（GST-AtHYL1-6×His）、具有两个RBD的dsRBD12（6×His dsRBD12）和单独的dsRBD1进行了凝胶阻滞分析（EMSA）（图5C）。使用不同的GC（带有4个茎环的人工前体的成熟形式，图3A）和3个不同的HYL1孵育标记的21-nt双链体RNA。令人惊讶的是，6hHis dsRBD12没有与任何底物有效结合（数据未显示）。但是，dsRBD1和GST-AtHYL1都更有效地与52％GC含量的双链RNA结合（图5E）。这些结果清楚地表明了HYL1在根据其GC成分特异性选择茎环结构中的作用。dsRBD1对dsRNA具有更高的亲和力并确定底物特异性，并且该域中的特定氨基酸可能会介导特定区域的选择。将拟南芥dsRBD1的5个DRB序列与其他同源物（如frog X1RBPA dsRBDs）的序列进行比对，显示HYL1的氨基酸残基具有对G或C的高特异性。具有突变残基S18→N、Y23→L的dsRBD1肽（图5C），与4个具有不同GC含量的21-nt双链体RNA进行了EMSA（图5E）。结果显示与WT肽相比，突变肽的结合几乎可以忽略不计（图5E）。
为了进一步验证该突变体缺乏与包含特定GC结构结合的能力，研究使用具有52％GC的miR528前体进行了结合测定。如图5F所示WT肽有效结合至pre-miR528结构，而突变没有结合（图5F）。总之，这些结果表明，HYL1可能介导miRNA前体转录物中特定区域的选择，以通过DCL1进行精确切割（图5G）。
人工miRNA的改进
除了以多种方式使用RNA干扰之外，还可以通过人工（a）miRNA在植物中实现靶标的特异性沉默。但是，由于处理不正确或定位效率低下，一些AMIR无法有效工作。本研究假设，如果amiR含有GC特征序列，可能会更有效地靶向作用。
通过WMD3在线工具，生成了针对葡萄MYBA7的候选amiR列表。 VvMYBA7是一种转录因子，能够在其表达后诱导花色素苷的生成。从可能的最佳候选对象（通常以绿色标记颜色）中选择了5种不同的GC含量和特征序列的amiR（图6A和B）。使用VvimiR828a作为对照，miR828GC含量低（33％）而导致积累水平低。带有和不带有amiR的VvMYBA7接种后3天，具有GC标记的候选物产生了丰富的amiR，而GC较低（33％）的候选物并未以最佳水平积累（图6E）。相应地用具有最佳GC含量和特征序列的amiR浸润的组织中的MYBA7 RNA和花色苷显着降低（图6C，D）。尽管从花青素积累中看到，amiR33介导的沉默在靶向MYBA7方面效果较差，但在组织中MYBA7 RNA的表达却出乎意料地较低。另一方面，amiR47没有高水平积累，但能够有效靶向MYBA7，且花色素苷积累减少。从nptII表达来看，所有浸润组织中转基因的表达水平相当（图6E）。尽管我们无法解释这些不完美的相关性，可能是由于可变的靶向能力、RNA分子的定位、RNA的稳定性以及靶标的可及性。
进一步使用GFP作为验证amiR技术改进的目标也证实了以上结果，这些结果表明，在amiR技术中结合特定的GC标记具有改善miRNA生物合成的能力，从而介导有效的RNA靶向沉默。
讨论
植物miRNA的合成已被广泛研究，但是尚不知道对于DCL1复合物进一步加工而言，究竟哪种RNA基序/区域优先合成。在动物中，miRNA的生物发生需要一组相对较好表征的决定簇。但是，与动物miRNA不同，植物miRNA在1至7位不显示AU富集。由于动物miRNA生物合成在许多方面都不同于植物，因此不可能将所有规则应用于植物miRNA生物合成。
本研究有可能为从长dsRNA中选择miRNA提供进一步的见解。在本报告中验证的GC特征序列的存在与以前的观察结果非常吻合。本研究生成了一个矩阵来比较和识别miRNA中的关键GC和AU特征序列。根据此分析，推断8–9、18–19带有G或C的位置是最重要的特征，其次是位于位置6的G。类似地，必须在位置5、7和10上具有A或U。在具有这些特征时miRNA的产量很高。本研究还发现，位置2–4的GC偏向性虽然很常见，但并不严格。这些特定GC标记可能会影响前体的局部结构，从而增强HYL1的结合和选择。
已鉴定的序列决定簇还与匹配miRNA的靶标RNA的序列特征密切相关，这是存在miRNA序列特征的有力证据。在植物中，miRNA靶向mRNA编码区内的近乎完美的互补，驱动了miRNA与靶基因共同进化。但是，在大多数植物中，mRNA通常显示出比其他RNA高的GC含量，这可能是将其与外来成分（例如富含AU的转座子）区分开的一种方式。
miRNA的特征与其前体有很大不同。植物miRNA前体具有较高比例的AU偏好，而其他非编码RNA中则没有。这与从其前体中选择miRNA更为严格并且可能起决定性作用的预测相符。植物miRNAs是从靶区域的反向重复进化而来的。选择突变以增加跨前体的AU富集而不是成熟miRNA/miRNA*区域中的突变，可能有助于对该区域的精确选择进行进一步处理。
本研究的一种可能的应用是对amiR技术的优化，该技术在动植物研究中极为有用并广受欢迎。基于Web的miRNA设计器工具（WMD）可用于多种植物，可针对给定的靶标设计基因特异性amiR候选物。但是，WMD通常会为每个目标基因生成数百个amiR候选物，通过序列互补性和杂交能量（dG）进行排名，但WMD3工具建议的许多候选物并未有效地使目标沉默。本研究结果强烈表明，在amiRs中掺入特定序列标记具有改善这一有用技术效率的潜力，使amiR成为更为有效的研究植物及作物遗传和功能基因组的技术。
评论
MicroRNA（miRNA）是进化上保守的一类小RNA（sRNA），参与了RNA的转录后调控。在植物中，大多数miRNA通过精确切割靶mRNA导致其降解而诱导经典的“沉默”。目前对于处理miRNA前体的核心复合物性质及功能研究较为透彻，但是对于精确加工miRNA需要的结构和序列决定簇尚未完全了解。这项研究表明植物miRNA具有独特的GC含量和特征序列，可能是在DCL1介导的长前体中选择精确区域所必需的。其GC含量和GC特征序列均起着重要作用，且miRNA靶标的mRNA也具有互补的特征。本研究提供了与动物不同的植物miRNA加工的深入认识，同时此发现在植物功能基因组学研究中的应用价值也十分重要。
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