科研 |THERANOSTICS：LncRNA DSCAM-AS1与YBX1互作激活FOXA1转录网络正反馈环促进癌症的进展
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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基本原理：FOXA1是乳腺癌、肺癌以及前列腺癌起始和发展过程中关键的转录因子。之前对FOXA1转录调控网络的研究主要聚焦于蛋白编码基因。长链非编码RNAs (lncRNAs)的调控网络以及它们在FOXA1促癌活性中的作用尚不清楚。
论文ID
原名：LncRNA DSCAM-AS1 interacts with YBX1 to promote cancer progression by forming a positive feedback loop that activates FOXA1 transcription network
译名：LncRNA DSCAM-AS1与YBX1互作激活FOXA1转录网络的正反馈环促进癌症的进展
期刊：theranostics
IF：8.579
发表时间：2020年8月
通讯作者：尹东
通讯作者单位：广东省恶性肿瘤表观遗传学及基因调控重点实验室
DOI号：10.7150/thno.47830
实验设计
结果
为了揭示FOXA1调控网络的关键致癌作用，研究者对应答FOXA1的致癌lncRNAs进行了整合分析。研究者首先在TCGA泛癌症数据中探究了FOXA1的表达图谱，结果发现前列腺癌(PRAD)、乳腺癌(BRCA)以及肺癌(LUAD)中FOXA1的表达显著升高（图1A）。相似的结果同样在CCLE数据库中发现（图1B）。这些结果与之前FOXA1在PRAD, LUAD以及BRCA中发挥促癌作用的报道一致。因此，研究者接下来在PRAD, BRCA以及LUAD中分析了异常表达的lncRNAs，结果发现在这三种癌症细胞中71种lncRNAs过表达（图1C）。通过分析Nacht等人发表的si-FOXA1 RNA-seq数据(GSE83785)，研究者在T-47D细胞中鉴定出214个FOXA1沉默后表达显著降低的lncRNAs。这些数据中，利用发表的ChIP-seq数据对FOXA1潜在的结合位点进行分析，挑选出5个重叠的lncRNAs（表S4）。其中DSCAM-AS1 (ENSG00000235123)在TSS (± 10kb)结合位点附近的数量最大（图1C）。因此DSCAM-AS1被用于进一步分析。
为了描述DSCAM-AS1的表达情况，研究者通过TCGA数据分析了其表达水平，结果发现其在乳腺癌、肺癌、以及前列腺癌中特异表达，而非邻近的正常组织（图1D）。在CCLE数据库中也得到了特异的表达图谱（图1E）。在肺癌中，大约1/5 (93 of 488)LUAD样本能够高表达DSCAM-AS1(FPKM>2)，但是在肺鳞细胞癌中表达很低。有报道称在乳腺癌中，DSCAM-AS1在ER+乳腺肿瘤组织中的表达高于ER-。尽管DSCAM-AS1在一些前列腺癌患者中高表达，在前列腺癌细胞系中表达水平很低（图S1C-D），可能是由于人类前列腺癌细胞系的数目有限。因此研究者将研究聚焦于DSCAM-AS1高表达的ER+乳腺癌和肺癌(图S1C-D)。
图1. 鉴定谱系特异且受FOXA1调节的lncRNAs。（A）TCGA数据库正常的和肿瘤样本中FOXA1的表达水平，每个点代表一个组织样本；（B）CCLE数据库中FOXA1的表达水平，每个点代表一个细胞系；（C）韦恩图说明FOXA1特异的lncRNAs，TCGA数据库中分析发现BRCA, PRAD以及LUAD中lncRNAs异常过表达。在三个肿瘤样本中71个lncRNAs高表达(FC ≥3, P <0.05)。这些lncRNAs随后与T-47D细胞RNA-seq筛选的214个FOXA1(FC≥ 2, P <0.05)诱导的lncRNAs重合，随后利用ENCODE中的ChIP-seq数据进行5个lncRNAs交叉点与FOXA1启动子区潜在的关联；（D）在正常和肿瘤样本中非编码RNAs的DSCAM-AS1的表达水平，每个点代表一个组织样本；（E）CCLE数据库中DSCAM-AS1的表达水平，每个点代表一个细胞系；(F-G) TANRIC数据库中FOXA1和DSCAM-AS1表达水平的相关性。
2 DSCAM-AS1是一个超级增强子驱动的lncRNA
由于癌症中异常表达的基因通常是由于拷贝数突变(CNVs)、表观和转录组学的异常调节导致的，研究者首先分析了DSCAM-AS1基因体中CNVs的状态。有趣的是，无论是乳腺癌还是肺癌都没有观察到显著的拷贝数扩增，提示CNVs并不是DSCAM-AS1扩增的原因。有报道称超级增强子参与谱系特异的表达并且决定细胞的命运，研究者猜想DSCAM-AS1的特异表达图谱可能受超级增强子调节。H3K27ac是活化增强子和超级增强子的标志物，因此研究者分析了乳腺癌和肺癌细胞中H3K27ac的信号。DSCAM-AS1是一个坐落在DSCAM内含子区域的反义lncRNA，近期有研究发现在DSCAM-AS1坐落区域鉴定出两个超级增强子。利用H3k27ac ChIP-seq数据证实在ER+中存在两个超级增强子的集簇，但是在ER-中没有（图2A）。SE1覆盖DSCAM-AS1的整个基因体，包括启动子区域（图2A）。SE2大约在DSCAM-AS1上游60kb。研究者也证实在DSCAM-AS1的启动子区域ERα的结合峰图显著。为了进一步探究SEs与DSCAM-AS1之间的相互作用，研究者利用T47D细胞中的Hi-C数据，Hi-C热图中发现SE2与SE1、以及DSCAM-AS1 TSS之间存在相互作用（图2B）。超级增强子相关基因对转录抑制剂高度敏感，即使是低浓度的抑制剂，例如CDK7的抑制剂THZ1以及BRD4的抑制剂JQ1。有报道称THZ1主要在三阴而不能在激素受体阳性的乳腺癌中发挥作用，因此研究者利用不同浓度的JQ1探究了其对DSCAM-AS1表达的影响。如图2C所示，和超级增强子驱动的致癌基因c-Myc一样，低浓度的JQ1(20 nM)就能导致DSCAM-AS1的显著降低，而管家基因GAPDH以及宿主基因DSCAM的表达不变。此外，ChIP-qPCR实验发现H3K27ac在DSCAM-AS1的上游以及基因体中显著富集（图2E-F）。总之，这些结果说明DSCAM-AS1受超级增强子的转录调控。
图2.DSCAM-AS1受FOXA1驱动超级增强子的正向直接调节作用。（A）在肺癌和乳腺癌中代表性超级增强子相关基因位点上H3K27ac、FOXA1以及ERα的ChIP-seq图谱。预测的SEs用黑条表示，y轴代表ChIP-seq的rpm，ChIP-qPCR引物的位置用一条短黑线表示，FOXA1和ER的结合基序在下面表示；（B）使用3D基因组浏览器(http://promoter.bx.psu.edu/hi-c/index.html) 生成交互式Hi-C热图，SEs和转录方向在热图下显示；（C）利用不同浓度JQ1处理MCF-7细胞，RT-qPCR分析DSCAM-AS1, c-Myc以及GAPDH的表达水平；（D）BRCA, LUAD以及PRAD中指定的细胞系进行siNC和siFOXA1处理，利用RT-qPCR检测DSCAM-AS1的表达水平；(E-F) 在MCF-7（图E）以及NCI-H1437（图F）细胞系中利用不同的引物进行H3K27ac的ChIP-qPCR，引物的位置如图A所示；(G-H) 在MCF-7（图G）和NCI-H1437（图H）细胞中对FOXA1的富集进行ChIP-qPCR分析，引物的位置如图A所示。
3 DSCAM-AS1通过FOXA1转录活化
超级增强子是一个大的增强子集簇并且结合有异常高水平的TFs，驱动基因的转录。为了探究能够活化DSCAM-AS1表达的TFs，研究者利用ChIPBase 和JASPAR对启动子区域进行了基序分析。FOXA1和ERα是最优的候选基因，并且结合基序靠近TSS。此外，ChIP-seq的数据发现FOXA1的显著峰图靠近TSS（图2A）。研究者利用TCGA乳腺癌和肺癌数据库分析了FOXA1和DSCAM-AS1之间的表达图谱。在乳腺癌和肺癌患者中，FOXA1高表达的肿瘤样本中DSCAM-AS1显著高表达(图1F-G)。FOXA1作为一个先锋因子，在雌激素受体转录中发挥重要作用。为了进一步证实FOXA1占据在DSCAM-AS1的启动子区域，研究者通过ChIP-qPCR对ChIP-seq鉴定出的FOXA1和ERα潜在的结合位点进行验证。在MCF7和NCI-H1437中FOXA1显著富集（图2G-H）。为了进一步证实FOXA1对DSCAM-AS1发挥转录调节作用，研究者在肺癌、乳腺癌以及前列腺癌细胞中分别通过siRNA敲低FOXA1，qPCR和WB实验发现这些siRNAs能够有效的沉默FOXA1的水平。在FOXA1沉默后研究者观察到DSCAM-AS1的水平也戏剧性的降低（图2D）。这些结果说明在肺癌、乳腺癌以及前列腺癌中FOXA1能够直接与DSCAM-AS1的启动子区结合并且调节其表达。总之，DSCAM-AS1是FOXA1的直接靶基因。
4 敲除DSCAM-AS1抑制乳腺癌和肺癌细胞的生长
研究者在乳腺癌和肺癌中进一步探究了DSCAM-AS1的生物学功能，通过三个siRNAs敲低其表达，qPCR实验证实DSCAM-AS1被成功的沉默。研究者观察到沉默的DSCAMAS1能够显著降低乳腺癌细胞的增殖和克隆生长（图3A-B）。流式实验证实敲低DSCAM-AS1能够导致乳腺癌细胞中G1-S期转变受到抑制。与之前的报道一致，DSCAM-AS1能够促进乳腺癌的发生发展。利用两个sgRNAs通过CRISPR/Cas9将DSCAM-AS1敲除（图3C），qPCR的结果说明DSCAM-AS1的表达显著降低，而宿主基因DSCAM的表达或者剪接并不受影响。在乳腺癌和肺癌中敲除DSCAM-AS1发现细胞的生长受到显著的抑制（图3D）。研究者没有成功构建出纯合的DSCAM-AS1-敲除的细胞，可能由于DSCAM-AS1对癌细胞的生长至关重要。
图3. DSCAM-AS1通过调节FOXA1和ERα 的表达发挥致癌作用。(A-B) MTT（图A）和克隆形成（图B）说明分别用三组siRNAs敲低DSCAM-AS1后细胞生长受到显著抑制；(C) 图例说明CRISPR/Cas9敲除DSCAM-AS1；(D) 在MCF-7和NCI-H1437细胞中敲除DSCAM-AS1后克隆形成降低；(E-F) 沉默DSCAM-AS1后FOXA1的mRNA水平（图E）和蛋白水平（图F）；(G) qPCR说明MCF-7和NCI-H1437细胞中敲除DSCAM-AS1后FOXA1的mRNA水平；(H-K) 在MCF-7细胞（图H）和T47D细胞（图J）中利用siRNA沉默DSCAM-AS1后ERα的蛋白水平，以及MCF-7（图I）和T47D细胞（图K）中ERα的mRNA水平。
5 DSCAM-AS1能够调节FOXA1和ERα的表达
超级增强子相关的TFs通常彼此间能够形成正反馈回路，成为核心转录调控回路（CRC）。CRC对细胞中细胞类型特异的转录调节至关重要。为了探究超级增强子相关的lncRNA是否也能够调节TFs的表达并且参与形成CRC，研究者在乳腺癌和肺癌细胞中敲除DSCAM-AS1后检测了FOXA1的表达水平。qPCR实验发现FOXA1 mRNA水平在DSCAM-AS1沉默后也显著降低（图3E），提示DSCAM-AS1可能调节FOXA1在转录水平的表达。WB实验发现DSCAM-AS1沉默能够降低FOXA1的蛋白水平（图3F）。FOXA1表达的降低进一步在MCF7和NCI-H1437细胞中利用CRISPR/Cas9敲除DSCAM-AS1验证（图3G）。
ERα是ER+乳腺癌中与FOXA1共结合的主要调节因子，这一过程对乳腺癌的起始和发展至关重要。同样有报道称FOXA1与ERα正相关，并且DSCAM-AS1受ERα的调节。因此研究者猜想DSCAM-AS1可能也调节ERα的表达。正如所期望的一样，DSCAM-AS1沉默或者敲除后ERα的表达也显著降低（图3H-K）。这些数据说明DSCAMAS1能够调节FOXA1和ERα的表达。
6 DSCAM-AS1与YBX1相互作用
为了进一步探究DSCAM-AS1对FOXA1和ERα调节的分子机制，研究者在MCF-7细胞中进行了RNA pull-down实验，银染结果证实在50KD具有显著更强的条带（图4A）。研究者进一步通过质谱证实（图4B）。通过质谱得到两个最优的候选者SURF-6以及YBX1。由于lncRNAs的功能通常依赖于它们结合的蛋白。研究者首先沉默了SURF-6，但是并未观察到细胞增殖的减弱（图S3A-D）。因此另一蛋白YBX1引起了研究者极大的兴趣。YBX1是一个DNA结合和RNA结合的蛋白，在转录和转录后水平调节基因表达中发挥重要作用。近些年在包括乳腺癌、肺癌在内的不同种类癌症中YBX1的促癌作用已有报道。通过RNA pull-down质谱鉴定出的DSCAM-AS1与YBX1相互作用利用anti-YBX1抗体通过WB验证（图4C）。研究者进一步通过RIP-qPCR实验证实了相互作用存在，在MCF-7和NCI-H1437细胞中YBX1导致DSCAM-AS1显著富集（图4D-E）。对于功能研究，研究者通过siRNAs敲低YBX1（图4F），利用MTT和克隆形成MCF-7细胞的增殖受到显著抑制（图4G-H）。这些数据说明DSCAM-AS1的功能依赖于YBX1相互作用。
图4. DSCAM-AS1与YBX1相互作用。（A）RNA pull-down后利用tRNA至tRSA系统对DSCAM-AS1相关蛋白进行银染，空的tRSA载体作为对照组，红框内的条带切下进行质谱分析；（B）切下条带的质谱结果；（C）利用YBX1抗体在RNA pull-down后对蛋白进行免疫印迹；(D-E) RIP-qPCR说明MCF-7（图D）和NCI-H1437（图E）YBX1的免疫沉淀中DSCAM-AS1的富集；（F）qPCR证实YBX1 siRNAs的敲低效率；(G-H) MTT实验（图G）和克隆形成实验（图H）说明YBX1敲除后细胞生长的改变。
7 DSCAM-AS1的敲除能够影响YBX1在FOXA1和ERα启动子区域的招募
除了作为一个RNA结合蛋白，YBX1同样也作为一个转录因子。之前的报道称lncRNA能够与YBX1相互作用并且影响YBX1的转录水平。因此研究者猜想DSCAM-AS1可能通过YBX1调节FOXA1和ERα的表达。通过分析YBX1的ChIP-seq数据，研究者观察到FOXA1和ERα启动子区域的峰图显著。这些结合位点进一步通过ChIP-qPCR实验证实。此外，敲低YBX1会导致FOXA1和ERα在mRNA和蛋白水平受到抑制（图5A-F），说明YBX1能够转录活化FOXA1和ERα。利用ChIP-qPCR实验，研究者对FOXA1和ERα启动子区域YBX1占据的改变进行了评估。当沉默DSCAM-AS1后，YBX1的招募显著降低（图5J-L）。这些结果提示DSCAM-AS1的敲除能够影响YBX1在FOXA1和ERα启动子区域的招募，并且降低两者的转录活性。
图5. DSCAM-AS1能够促进YBX1在FOXA1和ERα启动子区的招募促进它们的表达。(A-C) WB实验说明MCF7 (A)、T47D (B)以及NCI-H1437 (C)中敲除YBX1后YBX1、 FOXA1 以及ERα的蛋白水平；(D-F) qPCR证实MCF7 (D), T47D (E)以及NCI-H1437 (F)中敲除YBX1后YBX1、FOXA1 以及ERα的RNA水平；(G, I) ChIP-qPCR说明在MCF7(G)以及NCI-H1437 (I)中YBX1在FOXA1启动子区域的富集；(H) ChIP-qPCR证实YBX1在ERα启动子区域的富集；(J, L) ChIP-qPCR说明在MCF7 (J) and NCI-H1437 (L)细胞中沉默DSCAM-AS1后YBX1在FOXA1启动子区域的富集变化；(K) ChIP-qPCR提示在NCI-H1437细胞中敲除DSCAM-AS1后YBX1在ERα启动子区域的富集变化。
8 DSCAM-AS1的临床相关性以及体内功能研究
由于DSCAM-AS1在一些乳腺癌和肺癌患者中的表达显著升高，研究者随后探究了改变的DSCAM-AS1表达的临床相关性。在一个U133 Plus 2.0基因芯片平台中特异靶向DSCAM-AS1的探针能够探究其在一些公共数据库中的表达。为了探究DSCAM-AS1表达的临床相关性，研究者利用KM-plotter数据库在肺癌和乳腺癌中进行了Kaplan-Meier分析，结果发现DSCAM-AS1的高表达与ER+乳腺癌患者的存活低显著相关，而OS和RFS更短于DSCAM-AS1低表达的患者（图6A-B，P <0.05）。在肺癌中也观察到了相似的结果（图6C-D，P <0.05）。此外，研究者分析了DSCAM-AS1相互作用蛋白YBX1的临床相关性，结果发现YBX1的高表达与预后差相关。为了在体内探究DSCAM-AS1的功能，研究者利用MCF7 DSCAM-AS1 KO细胞进行了异种移植实验，DSCAM-AS1的敲除能够影响MCF-7移植瘤的生长（图6E-F）。与对照组相比，DSCAM-AS1敲除的细胞成瘤速率显著更低（图6E-F）。
图6.DSCAM-AS1是一个潜在的生物标志物和治疗靶向。(A, C) Kaplan-Meier图说明在ER+乳腺癌（A）和肺癌（C） 中DSCAM-AS11的表达水平和整体生存期之间的相关性；(B、D) Kaplan-Meier图说明在ER+乳腺癌（B）和肺癌（D）中DSCAM-AS1的表达水平与无复发生存期之间的相关性；(E) 接种KO-NC或者KO-DSCAM-AS1 MCF7细胞裸鼠的生长曲线；(F) 在结束时间点肿瘤成像；(G) 模式图说明DSCAM-AS1与YBX1协同作用促进FOXA1和ERα表达。
结论
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