科研 | Journal of Autoimmunity：强直性脊柱炎中促炎性肠道微生物群的宏基因组分析(国人作品)
编译：卓求，编辑：小菌菌、江舜尧。
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强直性脊柱炎（AS）作为一种主要影响骶髂关节和脊柱的慢性炎症性疾病，被报道与肠道微生态紊乱有关。本文通过对未经治疗的AS患者粪便进行深度测序，旨在深入了解AS患者的肠道微生物群。本文采用宏基因组鸟枪测序法对85例未治疗AS患者和62例健康对照者的粪便基因组进行分析，并收集23例AS患者经治疗后的粪便进行比较。并对AS、类风湿性关节炎和白塞氏病进行了比较分析，以揭示与炎症性关节炎相关的一些共同特征。ELISpot分析也证实了一种微生物肽的分子拟态。共鉴定到AS患者所富集菌种包括Bacteroides coprophilus、Parabacteroidesdistasonis、Eubacterium siraeum、Acidaminococcus fermentans和Prevotella copri。通路分析表明AS患者肠道微生物群中氧化磷酸化、脂多糖生物合成和糖胺聚糖降解增加。随机森林模型筛选出的AS肠道微生物的特征具有高区分度。一些与自身免疫有关的共同特征也被发现，如脆弱类杆菌和III型分泌系统（T3SS）。最后，体外实验证明一种由AS富集菌产生的细菌肽模拟II型胶原并触发了产IFN-γ细胞数量的增加。以上结果表明未经治疗的AS患者的肠道微生物群受到干扰，一些AS富集物种可能通过分子拟态触发自身免疫。另外，不同的炎性关节炎有一些共同的微生物特征。
论文ID
原名：Metagenomicprofiling of the pro-inflammatory gut microbiota in ankylosing spondylitis
译名：强直性脊柱炎中促炎性肠道微生物群的宏基因组分析
期刊：Journal of Autoimmunity
IF：7.543
发表时间：2019
通信作者：张烜
通信作者单位：北京协和医院
引言
强直性脊柱炎（AS）是一种常见的慢性炎症性疾病，影响骶髂关节和脊柱，伴有或不伴有周围性关节炎和其他全身症状。AS的病因尚不清楚，遗传危险因素包括HLA-B27被认为与AS的发病有关。此外，环境因素，特别是微生物，也被发现扮演着重要的角色。
人类的肠道定殖着数以万亿计、多达1000种不同的微生物。研究表明，肠道菌群失调与多种炎症疾病有关，包括炎症性肠病（IBD）、类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）。其他如反应性关节炎等脊椎关节炎的证据也表明，紊乱的人类共生菌具有致病性。半数AS患者出现了显微镜下的肠道炎症。HLA-B27转基因大鼠在无菌条件下保持健康，而在正常喂养环境下却发病，抗生素治疗可减轻蛋白聚糖诱导的小鼠疾病进展。通过对回肠远端活检进行16S核糖体RNA基因测序，结果表明AS患者肠道微生物群的不同组成，在科水平上具有差异表达分类群。最近的研究也揭示了AS进展中一些新发现的可能致病的分类群。然而，对于AS患者肠道菌群的紊乱，我们还远未达成共识。原因可能是之前的研究中使用的样本量很小，其中大多数没有使用深度测序或排除药物的影响。此外，肠道微生物群与AS之间的因果关系到目前还没有得到充分的研究。
在这里，我们用宏基因组鸟枪测序法对85名未经治疗的AS患者和62名健康对照（HCs）的粪便基因组进行检测。为了比较，还包括23例AS患者的治疗后的粪便基因组。并获得了宏基因组物种和KEGG功能数据，以分析肠道微生物特征。重要的是，还对不同的自身免疫疾病队列的微生物特征进行了比较分析。此外，我们还进行了功能性实验，并通过分子模拟证明了微生物肽在引发炎症反应中的作用。
实验设计
共招募85例AS患者和62例15～65岁HCs，所有患者在首次就诊时均未接受治疗。目前患有胃肠道疾病、慢性或急性感染或严重潜在疾病（如急性冠状动脉综合征、慢性肾功能衰竭和肿瘤）的受试者也被排除在外。并从这些AS患者中收集23份治疗后粪便样本进行比较。粪便样本采集后放置在-80℃下，2小时内快速冷冻并用干冰寄送，在Illumina平台上对样本进行双端测序，并最终实现物种和功能注释。
结果
1.紊乱的AS肠道微生物组成与功能
对原始数据进行质控后，平均每个样本获得7300万有效序列，然后将每个样本的有效序列和9.9 M人类参考基因组进行比对得到基因文件。健康对照组和AS组的比对率无显著差异。
AS患者的基因数和Shannon指数均显著下降，PCoA图也表明AS患者和HCs之间肠道微生物群的分布不同。
通过粪便宏基因组数据发现未经治疗的AS患者存在14个MGS增加，94个MGS减少。在被富集的MGS中，有7个被注释，包括Bacteroidescoprophilus DSM_18228、Parabacteroides distasonis ATCC_8503、EubacteriumsiraeumV10Sc8a、Acidaminococcusfermentans VR4_DSM_20731-mgs0807和Prevotella copriCB7_DSM_18205（图1）。
图1 AS患者与健康对照组肠道微生物的MGS分析
有趣的是，23名治疗后患者的粪便样本表明Prevotella copriCB7_DSM_18205减少了（图2A）。一些AS减少的物种如 Enterococcusfaecium E980和TX0133a01经治疗后增加了。此外，在接受TNFi/DMARDs治疗的患者中，AS富集物种Prevotella copri CB7_DSM_18205比仅接受非甾体抗炎药（NSAIDs）的患者恢复更为显著(图2B)。
图2 部分恢复的AS患者肠道微生物群
至于功能分析，有三个主要途径涉及AS，包括氧化磷酸化，脂多糖（LPS）生物合成和糖胺聚糖降解（图3）。与氧化磷酸化相反，AS患者肠道微生物群糖酵解和糖异生途径减少。健康对照组中最富集的通路是磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶（PTS）系统和ATP结合盒（ABC）转运体。值得注意的是，AS患者体内一种具有抗炎活性的微生物代谢产物丁酸的代谢途径减少，且丙酸代谢亦呈下降趋势（图3）。
2. 肠道微生物群与临床指标和诊断模型的相关性分析
在所有测试的临床指标中，贝氏强直性脊椎炎活性指数（BASDAI）与AS患者肠道微生物群密切相关。此外，我们发现AS富集菌Acidaminococcusfermentans VR4_DSM_20731的相对丰度与BASDAI呈现正相关，而AS富集菌Parabacteroides distasonisATCC_8503则相反。AcidaminococcusfermentansVR4_DSM_20731也和一种外周关节炎表型相关。在AS肠道中减少的Ruminococcus obeum A2−162和 Dorea longicatena DSM_13814与HLA-B27的存在呈正相关。
此外，我们还建立了随机森林模型，70%的样本被随机挑选为训练集，余下的30%则组成了测试集，训练集和测试集的受试者工作特征曲线下面积分别为 89.7%和82.6%（图4A）。18种MGS标志物被鉴定为主要的分类器，其中在AS肠道中下降的Gordonibacterpamelaeae7-10-1-bT_DSM_19378具有最高预测准确性，Bacteroidescoprophilus DSM_18228在AS富集菌中最高预测准确性。此外，我们发现与治疗前相比，治疗后疾病的概率下降（图4C）。
3. 不同炎性关节炎的比较分析
为了研究不同炎症性关节炎患者肠道微生物群的一致性和差异性，我们利用了我们队列和其他已发表队列的数据，分别获得57例RA和24例BD的宏基因组序列数据，并得到物种和功能注释。
我们发现Bacteroides fragilisNCTC_9343、Bilophilawadsorthia3_1_6和AlistipesfinegoldiiAHN_2437_DSM_17242在炎性关节炎肠道中上升，而Prevotellabivia653C_DSM_20514和EubacteriumbiformeDSM_3989则相反。我们再次建立了一个随机森林模型，以确定是否存在针对不同炎症性关节炎的特定生物标记物。根据微生物特征对不同炎性关节炎的聚类显示，AS和RA之间的关系比其他组更密切，这与它们都是炎性关节炎的临床性质一致。根据最小最大转化重要度指数，包括GordonibacterPamelaae7-10-1-bT_DSM 19378和Sutterellawadsworthensis 3_1_ 45B在内的类群的变化与AS和RA高度相关。随机森林模型中包括三种Faecalibacteriumprausnitzii（一种在AS患者中减少并通常报告有益的丁酸盐产生菌），可以区分不同的组，并且每种菌都与三种炎症性关节炎有明显的关系（图5）。
我们进一步比较了三种不同炎症性关节炎的途径和模块模式。在细菌分泌系统方面，Ⅲ型分泌系统（T3SS）在自身免疫宏基因组的丰度明显高于对照组。糖酵解被证明是RA和BD中最丰富的途径，但AS患者更倾向氧化磷酸化和 柠檬酸循环。糖胺聚糖降解途径与其他多糖降解在AS和RA的肠道菌群中，显著增加。
4. AS肠道富集菌产生微生物肽增强IFN-γ产生能力
为了从实验上证实AS与肠道微生物之间的潜在关系，我们将AS肠道中上调的物种（Q<0.1）的蛋白质序列与从IEDB（免疫表位数据库3.0）检索到的自体表位进行了匹配，后被证明通过抗原抗体反应刺激AS患者的CD8+T细胞应答。三种细菌肽与AS自体表位的相似度超过80%，均由HLA-B27提呈抗原肽给CD8+T细胞。鉴于IFN-γ的产生通常被用作CD8+T细胞活化的指标，我们随后进行了ELISPOT实验来测试这些肽诱导的外周血单个核细胞（PBMCs）的IFN-γ分泌。被Bacteroides fragilis 3_1_12 的“HIGQPGVIG”模拟来自II型胶原的“ARGQPGVMG”刺激后，只有来自于具有HLA-B27的AS患者的外周血单个核细胞而不是来自健康受试者的外周血单个核细胞表现出过度的IFN-γ产生能力（图6）。
图6 模拟自身抗原的微生物肽能够触发IFN-γ的分泌
讨论
在这里，我们的宏基因组研究确定了AS肠道微环境的一些组成和功能模式，并将我们的发现与来自其他炎症性关节炎队列的宏基因组数据进行了比较。我们发现，Bacteroides coprophilus、Parabacteroides distasonis、Eubacterium siraeum、 Acidaminococcusfermentans和Prevotella copri是AS肠道中特异性富集的标志物，并增加了氧化磷酸化、LPS生物合成和糖胺聚糖降解等途径。我们也构建了一个MGS为基础的性能良好的随机森林分类器。ELISPOT实验证明一种AS富含菌种所产生的肽，模拟AS自身抗原II型胶原，作为以IFN-γ分泌为特征的自身免疫反应的触发因子。AS患者α多样性降低，其特征是基因数和Shannon指数均下调。基于Bray-Curtis距离的降维分析也揭示了AS患者和HC之间的微生物分布差异。在我们的AS队列中，发现包括Bacteroides coprophilus、Parabacteroides distasonis、Eubacterium siraeum、Acidaminococcus fermentans和 Prevotellacopri在内的物种增加，其中Prevotella copri先前被另一个宏基因组研究认为在AS肠道中升高。然而，之前的研究并没有排除服用免疫抑制药物的患者，据报道这些药物会干扰肠道微环境。我们对AS患者的随访数据和先前对RA患者的观察都清楚地表明，DMARDs治疗可以影响肠道微生物群的组成。例如，AS所富含菌Prevotella copri在治疗后显著减少。有趣的是，用DMARDs或TNF-α抑制剂（TNFi）治疗比仅用非甾体抗炎药治疗有更大的降低Prevotella copri的能力。Prevotella copri是上述最突出的一种，与许多具有致病性的疾病有关，尤其是在炎症性关节炎中。据报道，它在临床前类风湿关节炎患者中富集，且在类风湿关节炎患者的滑液中检测到它的DNA。此外，在无菌条件下对关节炎具有抵抗力的关节炎小鼠模型，在单殖入Prevotella copri后发生了严重的关节炎，并伴有丰富的结肠和腘淋巴结中的Th17细胞。鉴于AS是脊椎关节炎的原型，关节炎的一个常见亚型，上述事实提示了 Prevotella copri和AS之间可能存在因果关系。
根据宏基因组序列的功能注释，AS患者的肠道微生物群具有增加的氧化磷酸化和柠檬酸盐循环，以及减少的糖酵解。选择耗氧量较大的能量代谢可能反映了紊乱肠道微生物所面临的氧化应激，有利于兼性厌氧菌的生存，而不是大多数专性厌氧的肠道共生菌。AS肠道菌群的内毒素的生物合成和输出功能均提升，与AS患者血清LPS水平升高一致。据报道，当脂多糖被注射到小鼠关节时，也会引发关节炎，这表明升高的脂多糖对AS具有致病作用。糖胺聚糖是骨基质的主要有机成分，硫酸化的糖胺聚糖可以保护胶原纤维免受酸变性。其他研究报道糖胺聚糖是肠屏障的重要组成部分。AS患者体内糖胺聚糖降解途径增加，提示其可能导致骨破坏和肠道完整性损害。PTS系统和ABC转运体都是微生物转运系统的重要组成部分，其在肠道内的下调表明微生物维持细胞内分子平衡的能力有缺陷。丁酸代谢在肠道菌群中减少。丁酸盐是SCFAs的主要成分之一，长期以来一直具有很强的抗炎作用。与这一观察结果一致，我们的AS患者中也发现了一些能够产生SCFAs的物种，如Eubacterium hallii、Coprococcus catus、Faecalibacterium prausnitzii和Coprococcus eutactus减少。为了使这些微生物组成数据具有临床意义，我们对未经治疗的AS患者的肠道微生物相对丰度和临床指标进行了Spearman相关分析。BASDAI是最常用的疾病活动评分，与肠道微生物分布的相关性最强。Acidaminococcus fermentans是唯一与BASDAI呈显著正相关的AS富集菌种。然而，Acidaminococcusfermentans与人类病理的联系尚未得到研究。 Ruminococcus obeum和Coprococcus catus与AS疾病活力得分呈负相关，且在AS肠道中呈下降趋势，提示这两种共生菌的有益作用。有趣的是，我们发现在肠道中减少的Ruminococcus obeum和Dorea longicatena与HLA-B27的存在呈正相关。基于MGS相对丰度建立随机森林分类模型，将AS患者与HC患者区分开来，训练组和测试组的AUC分别达到89.7%和82.6%。最具鉴别力的MGS是一种在AS肠道中减少的物种即Gordonibacterpamelaeae。 Gordonibacter pamelaeae以其在鞣花酸代谢中的作用而闻名。尿石素A是鞣花代谢产物，据报道通过抑制中性粒细胞发挥抗炎活性。研究还表明鞣花酸能改善炎症性结肠炎和关节炎大鼠的炎症反应。
在具有可比样本量的AS、RA和BD队列中进行多队列分析，以探讨炎症性疾病肠道微生物群的共同特征。结果表明，在这些炎症性疾病中，Bacteroides fragilis (NCTC_9343)、Bilophilwadsworthia和Alistipes finegoldii上升，而 Prevotella bivia和Eubacterium biforme则相反。据报道，Bacteroides fragilis在儿童附着点相关关节炎中增多。然而，Bacteroides fragilis的多糖A与抗炎特性相关，而Bacteroides fragilis毒素据报道是促炎和致癌的。因此，Bacteroides fragilis在免疫病理中的确切作用值得进一步研究。众所周知，Bilophila wadsworthia是一种亚硫酸盐还原性致病菌，能够产生有害的代谢物硫化氢，据报道，当口服给特定的无致病性小鼠时，会引发全身炎症。另一个丰富的物种Alistipes finegoldii激活IL-6/STAT3信号促进结肠炎小鼠炎症反应。就通常改变的功能而言，T3SS分泌功能在所有三个关节炎队列中明显富集。T3SS像注射器一样向宿主细胞输送毒力因子，可能通过诱导组蛋白H3的去磷酸化和去乙酰化，扰乱许多细胞功能，如细胞骨架、运输和细胞死亡。在我们的AS队列中，T3SS模块的升高可能是由Tannerella sp、Eubacterium siraeum、Bacteroidesfragilis和Odoribacter splanchnicus等物种的富集引起的，它们都具有这种分泌系统。
在AS和RA队列中，大量减少的Gordonibacter pamelaeae和富集的Sutterella wadsworthensis是最具鉴别能力的物种。Sutterella wadsworthensis在溃疡性结肠炎接受分菌移植后未能达到缓解的患者中增加，提示其对平衡肠道菌群的干扰作用。Sutterella wadsworthensis能刺激肠细胞分泌白细胞介素（IL）-8，白细胞介素是一种能诱导炎症趋化和吞噬的化学因子。有趣的是，AS患者的血清IL-8水平与AS疾病活动评分呈正相关，AS患者的回肠IL-8表达也与肠道炎症有关。
自体抗原和微生物组分之间的交叉反应一直被认为是自身免疫的触发因素。利用生物信息比对，我们从我们的AS队列中富集的物种中发现了三种微生物肽，它们与已证实的AS自身表位有着密切的相似性。脆弱拟杆菌表达的一种微生物肽“HIGQPGVIG”能刺激AS患者外周血单个核细胞分泌IFN-γ，而健康人外周血单个核细胞则无相同的炎症反应。这不是第一次脆弱拟杆菌与分子模拟有关。脆弱拟杆菌的BfUbb蛋白可能与人泛素相似，与自身免疫病人血清IgG结合。我们新发现的脆弱拟杆菌肽模拟的人类蛋白质是II型胶原，是关节软骨的主要结构。因此，我们有理由推测，由微生物肽引发的自身抗体可能通过损伤炎性关节软骨加重病情的发展。尽管已经在AS患者中进行了多项肠道微生物群研究，但我们仍远未明确肠道微生物群失调与AS发病之间的因果关系。与其他炎症性疾病如类风湿关节炎（RA）不同，类风湿关节炎的发展已被证明部分归因于肠道失调，任何特定微生物类群与AS发病机制之间的确切关系尚未报道。
通常，各种微生物都可以发挥作用，因为微生物群代表着一个复杂的生态系统，没有一种微生物能区分开来HC和AS。尽管我们的模拟研究揭示了受干扰的微生物可能对AS的影响，但利用纯化的微生物和动物模型进行进一步的机制研究是有必要的。此外，还应探索和揭示介导特定分类群对AS病理学影响的确切微生物成分或代谢物。
综上所述，我们对未经治疗的患者粪便样本进行深度测序的结果表明，肠道微生物群在AS肠道中受到干扰，这是由AS队列和HCs之间的组成和功能差异所揭示的。利用相关的微生物特征建立诊断性随机森林模型，取得了良好的效果，强调了特定分类群在鉴别AS患者和预测预后方面的潜力。此外，不同炎性关节炎组间的比较分析揭示了一些微生物和途径的致病作用，揭示了一些共同的特征。最后，体外实验证明了一种微生物肽通过分子模拟促进异常免疫反应的能力，这可能是HLA-B27阳性AS的触发因素。总之，我们的研究提供了与AS肠道失调相关的深入知识，而新发现的AS相关肠道微生物的确切作用和功能途径值得进一步探索。
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