科研 | SBB：高山森林外生菌根通过根和菌丝获得有机和无机来源的氮（国人作品）
编译：沐秋，编辑：小菌菌、江舜尧。
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与植物根系相关的外生菌根真菌（ECM）在促进植物养分吸收方面发挥着重要作用。外生菌根树可以通过根际直接吸收（即根途径）获得土壤N，也可以通过外生菌根真菌的菌丝体获取土壤N，然后转移到细根（即菌丝途径）。然而，根途径和菌丝途径对植物获取的不同土壤N源的相对贡献比率还未明确，这在理解森林生态系统中植物N获取策略和植物-菌根互作研究中留下了关键的空白。
在这项研究中，我们结合生长核心法和原位15N标记技术，量化了两个外生菌根高山森林的根和菌丝途径对植物N的吸收（无机N和有机N）。我们发现，在两个森林的不同季节中，植物主要通过根途径获得土壤中的无机N（81.9%），而通过ECM真菌菌丝体获得44%的有机N。菌丝体途径对植物有机N吸收的贡献在非生长季（52.6%）显著高于生长季（35.5%）。
研究表明，在高山针叶林中，ECM真菌的菌丝体在植物有机N循环中起着至关重要的作用。与ECM真菌相关的植物可以根据其对N的需求和土壤N的有效性来调节根途径与菌丝途径的主导优势。本研究为了解外生菌根对森林生态系统N循环和结构功能的影响提供了新的思路。
论文ID
原名：Plant nitrogen acquisitionfrom inorganic and organic sources via root and mycelia pathways inectomycorrhizal alpine forests
译名：根高山森林外生菌根通过根和菌丝获得有机和无机来源的氮
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019
通讯作者：尹华军
作者单位：中国科学院成都生物研究所
实验设计
用网格状的生长芯将根部和表生菌丝的地下生长分割开来。内生芯由聚氯乙烯（PVC）管制成。根据菌根菌丝体（2-20 μm）的大小和菌根定殖率高的细根（<1 mm）选择网格大小。2015年7月，在每个研究点建立了4个间距大于50 m的10 m×10 m地块，并在每个地块安装了5对生长芯。从0-15 cm深的矿物土中收集土壤，以填充生长芯。每一个土壤部分都是分开的，肉眼可见的植物材料与岩石均被移除。然后将填土芯重新插入上部矿层的挖掘孔中，大多数根和菌根菌丝会在那里增殖。
2017年7月（生长中期）和12月（非生长期），在生长芯建立两年后，我们对生长芯进行了同位素标记实验。在施用示踪溶液之前，在每个样地的生长芯中采集土壤，以测定不同N源的背景值和通量。通过定量测定土壤在20℃黑暗条件下培养30天后溶解无机N（DIN，NH4+和NO3-）和2 M KCl提取的氨基酸库的变化，测定净N矿化率和净氨基酸生成率。用流动注射比色自动分析仪III（SEAL analytic，德国）测量土壤样品中的DIN浓度。随后，采用邻苯二甲醛和β-巯基乙醇（OPAME）法测定KCl提取物中氨基酸的含量。同时，在每个采样季节，用15 cm（直径5 cm）的土壤采样器采集土壤，对每个小区的树木细根生物量（<1 mm）进行量化，取芯后，立即在田间用1mm的筛网进行筛分，然后在冰上运回实验室。对土壤样品中的所有活根定量采摘、仔细清洗，然后在65℃下干燥，以测定总细根生物量（g m-2）。用颜色和质地来区分活根和死根（死根比活根更暗，更易碎）。
在每个地块中，四个随机选择的成对生长芯接收等量（20毫升）的双标记（U-13C2/15N）98%丰度甘氨酸、98%丰度15NH4Cl、98%丰度K15NO3或水（对照）。我们选择U-13C2/15N甘氨酸作为有机N吸收的同位素标记，因为甘氨酸是研究地点最丰富的氨基酸之一（图S2）。我们使用15NH4Cl和K15NO3作为标记材料。首先在每个生长芯上标记五个注入点，这样标记溶液就可以均匀地分布到芯上。使用注射器在每个注射点输送5 mL标记溶液，注射器与根际土壤溶液采样器（直径2.5 mm）耦合。该仪器内部有致密的微孔，尖端密封，可作为改良注射器在土壤剖面上均匀地输送溶液，最大限度地减少淋失。通过添加15N示踪剂，增加特定形态的15N丰度且最终丰度低于10%，以避免施肥效应。考虑到土壤中氨基酸的快速周转率，在标记6 h后收集根样，以使根最大限度地完全吸收氨基酸。我们之前的研究探索了同位素标记后的采样时间（2-48 h），结果表明，6 h更接近该研究区域发生完全吸收的临界点。
从土壤生长芯中小心收集细根，代表与表生菌丝结合的细根对N的吸收，提取外壁的根代表从表生菌丝向细根输送的N的部分。所有根样用流动水冲洗3 min，然后用0.5 mM CaCl2冲洗3 min，以去除吸附在根表面的剩余15N，然后在液氮中冷冻，以抑制根组织中氨基酸的进一步代谢。冷冻样品被运送到实验室，在65°C下烘干48 h，并使用球磨机研磨成细粉。用元素分析仪（Elementar Ltd，Hanau，德国）和同位素质谱仪（IsoPrime100，英国）对样品进行了全N、全C、δ15N和δ13C分析。考虑到在甘氨酸标记处理中没有观察到明显的13C富集，因此对甘氨酸处理的根样品进行了第二组分析，以提取根组织中的可溶性C组分。方法如下：35 mg研磨样品用3 mL 10 mM磷酸盐缓冲液（pH=8）提取，4200 rpm离心10 min。将上清液转移到试管中，用另外3 mL缓冲液重复提取过程。将每个样品的两种上清液混合，蒸发至最终体积100 μL，并转移至锡囊。在密封胶囊之前，将溶液在70℃下烘干，最后用元素分析仪和同位素质谱仪进行总N、总碳、δ15N和δ13C的分析。
标记后6 h（T；h）后，通过乘以细根的N含量（CN；μg N g-1根）和细根样品的15N原子百分超（U15N；μg 15N g-1根h-1）计算单位时间单位根质量15N的吸收量：U15N= C N×atom% 15 N excess/ T
假设15N标记能真实地反映树木根系对N的吸收，我们根据方程式计算了土壤中不同N形态的吸收速率（Nuptake；μg N g-1根h-1）：Nuptake=U15N×Cavailable N/C15N label
其中Cavailable N是土壤中每种形态N的浓度（μg N g-1土壤），C15N label代表15N添加的浓度（μg 15N g-1土壤）。植物根系从土壤中吸收N的总量（μg m-2 h-1）为每一地块中质量比吸N率和细根总生物量的乘积。从仅生活在菌丝体外壁的根中确定了从表生菌丝（运输到寄主植物的根）吸收的N量。通过从测量的总N吸收量中减去这部分N吸收量，计算根的N吸收量。
结果
在2年的时间里，生长芯和外壁的土壤N库浓度在不同的森林类型和采样季节均观察到显著差异，但其显著性差异取决于N形态的不同。特别是在人工云杉林的生长季节，菌丝体中土壤NH4+-N和氨基酸的浓度显著高于生长芯（P<0.05），而土壤NO3--N含量则无显著差异。而在云杉冷杉人工林，菌丝体中土壤NO3--N和氨基酸的含量显著高于生长芯（P<0.05），而土壤NH4+-N的含量则无显著差异。相比之下，在非生长季节，两种林分类型中生长芯的土壤氨基酸含量没有显著差异，而菌丝体中土壤NH4+-N和NO3--N含量均显著高于生长芯（P<0.05）（表1）。在不同森林类型和采样季节中，生长芯和菌丝体之间的净N矿化率和净氨基酸生成率没有显著差异。
处理6 h后，在根样品中观察到15N的富集。在生长季节，施用15N使两种森林中根样15N含量显著高于菌丝体外壁周围的15N含量（P<0.05），在两种森林中添加NH4+-N和NO3--N示踪剂后，根样中15N的丰度也明显大于菌丝体外壁周围15N的丰度（P<0.05）（表2）；相比之下，在人工云杉林中，15N甘氨酸的施用仅能显著提高根样中生长芯的15N丰度，而生长芯和菌丝体中15N丰度差异不显著。
研究发现细根吸收的植物N量明显大于菌丝体（P<0.05），占植物N吸收总量的69%。然而，森林类型和采样季节的不同显著影响了根和菌丝体对土壤中不同形态N的吸收量（表3；图1）。具体来说，在人工云杉林的生长季节，根系对土壤中NH4+-N、NO3--N和甘氨酸的吸收贡献分别比菌丝体大57.2%、80.8%和19.8%（图1a）；而在非生长季节，根系对土壤中NH4+-N和NO3--N的吸收贡献率分别比菌丝体高71.2%和25.0%，对土壤中甘氨酸的吸收贡献率比菌丝体低14.2%（图1b）。在云杉冷杉人工林中，根对土壤中NH4+-N和NO3--N的吸收贡献在不同季节均显著大于菌丝体（P<0.05），而根与菌丝体对土壤甘氨酸的吸收量无显著差异。
与细根相比，菌丝体在森林类型和采样季节的有机N（即氨基酸）和无机N吸收率均显著高于细根（P<0.05）（图2）。尤其在人工云杉林的非生长季节，菌丝体对有机N和无机N的吸收率超过100%（147.3%），是细根的5倍（图2a）。也就是说菌丝体对有机N的吸收量较高，对甘氨酸的吸收量也明显高于细根。
菌丝体对有机N的吸收表现出明显的季节性变化。与生长季相比，菌丝体对两种森林植物有机N的吸收在非生长季均显著增加（P<0.05）（图3），尤其在人工云杉林中，菌丝体在非生长季节对植物有机N吸收的贡献多达50%（57.3%）（图3），超过了细根。
图3 在生长季、非生长季的人工云杉林和杉木人工林中，ECM真菌菌丝体对植物有机N吸收的贡献率（%）。
讨论
虽然人们普遍认为ECM真菌在植物N素营养中起着关键作用，但很少有研究量化ECM真菌对植物吸收不同N源的贡献。在本研究中，我们发现植物主要通过根途径获得土壤中的无机N，而通过菌丝体途径获取有机N（图1）。此外，与根相比，ECM真菌的表生菌丝有较高的有机N吸收率（图2）。表生菌丝对植物有机N的吸收在非生长季节显著大于生长季节（图3）。虽然我们仍需要对其他森林和生态系统类型进行进一步研究以确定这些结果的普遍性，但是本研究中根途径和菌丝途径对植物N素吸收的差异和变化表明，植物通过调节根与外生菌根真菌菌丝体的相对主导优势来获得维持植物N素营养的N源。这些发现有助于我们进一步了解根系和菌根真菌在生态系统N循环和森林养分供应中的互作机制。
与我们的第一个假设相反，研究发现菌丝体途径对植物N吸收的贡献小于根途径（图1）。在本研究中，我们关注的是共生界面上的N转移，而不是外部真菌阶段的N吸收。根在植物吸N过程中所起的重要作用也可以从土壤有效N库的显著减少中得到证实，而生长芯中的土壤N转化率与菌丝体相比没有变化（表1）。根在土壤中吸收的的N明显增加，但对土壤N素转化的影响较小，使土壤有效N含量降低。这一结果与以前用15N自然丰度法估算的结果相反，后者发现ECM真菌提供了植物中61%-86%的N。如果当前研究和先前研究之间的ECM对植物N吸收的贡献差异与所用方法无关（自然丰度与同位素标记），这种差异则反映出了高山森林土壤的N有效性比北极苔原更高，后者N限制严重使得植物根系本身很难获得足够的N来满足植物的N需求。因此，在北极苔原生态系统中，在N有效性极低的土壤中生存的植物更可能依赖于ECM真菌的菌丝体来获取N。由于菌丝体对N的吸收和转移过程消耗了寄主植物的能量，当土壤N有效性超过N限制的阈值时，植物可以通过根途径获得足够的N，而不需要供给菌根真菌额外的碳源和能量。换句话说，没有菌根真菌，植物根系也能通过扩散和质量流量吸收必需的矿质N。因此，植物对菌根真菌的N依赖性与土壤N素有效性呈负相关。此外，已有研究表明，森林生态系统中真菌生物量和ECM菌丝体产量随着土壤N素有效性的增加而降低。但也有研究表明，随着N素有效性的降低，ECM真菌降低了吸收N素向寄主植物的转移效率。因此，ECM真菌N吸收量与土壤养分状况的关系仍不确定，有待进一步研究。
尽管与细根相比，ECM真菌菌丝体在植物吸收全N中的作用不那么重要，菌丝体途径对植物有机N的吸收贡献却很大（44%），且高于根途径（图2），这符合我们的第二个假设。前人研究表明，不同生态系统中（如北方森林、温带森林和北极苔原）的植物可以利用土壤中的有机N（主要是氨基酸）。然而，由于植物根系在与土壤微生物竞争有机N的过程中处于空间劣势，大多数植物对土壤有机N的吸收依赖于ECM真菌菌丝体的作用。虽然氨基酸不能代表土壤中总有机N库，但我们的研究证明了菌丝体主要以有机形式而不是无机形式参与植物对N的吸收。
植物对这两种N素吸收途径的依赖性在不同季节间存在显著差异（表3），其中菌丝体对植物有机N吸收在非生长季节显著大于生长季节（图3）。在两个森林的非生长季节，尤其是人工云杉林中，菌丝途径对植物N吸收的贡献增加，这主要归因于菌丝体吸收的有机N要高于细根（图1b）。不同季节土壤N库的变化可以解释在生长季节和非生长季节根和菌丝途径获取氨基酸的不一致结果。随着土壤温度的变化，土壤中无机N和有机N库的相对主导地位也发生了变化，从而影响了植物N素的获取策略。我们之前的研究也表明，与生长季节相比，人工云杉林在非生长季节土壤无机N含量明显下降，但积累了更多的氨基酸。与这一结果一致，本研究观察到了生长芯土壤N库的季节变化（表1）。假设人工云杉林土壤无机N库在生长季为了维持植物正常生长而保持较高水平，但在非生长季的寒冷条件下，土壤无机N的有效性可能会降低到一个临界水平，不能满足基本供N的需要。此时土壤中积累的氨基酸就可以作为植物在非生长季节的补充N源。由于季节变化，土壤中的主要N源由无机N向氨基酸转化，除了依靠根本身，植物可能需要更多地依靠菌根真菌来获取N，从而使菌丝体成为植物在非生长季节吸收有机N的主要途径（图3）。这一假设与之前的结论相一致，即只有在土壤N的矿化作用不足以满足植物吸收的情况下，通过ECM菌丝利用有机N而使N素循环“短路”才可能是重要的。值得一提的是，在非生长季节，N有效性较低也可能导致对ECM真菌的N限制，从而影响菌丝体途径对植物N的吸收。但是，由于ECM真菌土壤中的N吸收比细根更为有效，因此对ECM真菌的限N阈值可能要低于植物。此外，土壤有效N库的变化也可能会改变ECM真菌的群落组成，这可能是影响根和菌丝途径促进植物有机N吸收程度的另一个潜在因素。一般来说，土壤中N的有效性越低，利用有机N源的ECM真菌的优势性就越高，反之亦然。
总的来说，根和ECM菌丝对植物N吸收的季节性变化意味着植物可以在遇到气候和营养状态变化时平衡根和菌丝途径以使N吸收最大化。特别是在生长季节，高山针叶林植物主要依靠直接根系获得土壤无机N。相反，当土壤N素矿化在非生长季节受到限制时，该地区的植物将更多地依赖于菌丝体途径吸收植物根系不易获得的土壤有机N。
图4 在生长季节和非生长季节土壤中溶解无机N（DIN）和氨基酸N（AA-N）的植物获取过程中，根途径和菌丝途径相对贡献的假设概念模型。
结论
本研究表明，高山针叶林中的ECM植物主要通过根途径获得土壤N，尤其是无机N。然而，ECM真菌的表生菌丝对植物有机N的获取同样重要，这意味着在植物-菌根互作中，C投入和养分效益之间的权衡可能会介导植物N吸收的策略。与生长季相比，非生长季菌丝途径对植物有机N的吸收显著增加。这些结果表明，在土壤N素有效性随季节变化的情况下，植物N素获取中根途径和菌丝途径会随之改变。然而，鉴于外生菌根在许多森林生态系统中普遍存在，本研究结果可以为ECM真菌菌丝体在植物获取土壤中不同形态N中的重要性提供有力的证据，但是其重要性可能因森林生态系统和菌根类群的不同而不同。
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