科研 | mBio: DNA和RNA-SIP揭示硝化螺旋菌驱动地下水生物滤池中硝化过程
编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。
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硝化作用在微生物作用下将氨氧化为亚硝酸盐和硝酸盐，在全球氮循环中发挥核心作用。作者使用DNA和RNA稳定同位素标记技术（SIP）并结合16S rRNA扩增子测序，并使用13C-HCO3-作为碳源进行功能微生物标记，证实硝化螺旋菌谱系Ⅱ在生物滤池群落中主导氨氧化过程。
78种（RNA-SIP鉴定8种，DNA-SIP鉴定70种）硝化螺旋菌（99％16S rRNA序列相似性）进行全程氨氧化过程；96种（RNA-SIP鉴定25种，DNA-SIP鉴定71种）硝化螺旋菌执行亚硝酸盐氧化过程。在有利于氨氧化过程的条件下，Acidobacteriasubgroup10, Pedomicrobium, Rhizobacter和Acidovorax显著利用HCO3-。
硝化螺旋菌推动生物滤池中亚硝酸盐的氧化，在SIP不同分层馏分中未检测到古细菌氨氧化类群的活性。研究证明在进行相同生态过程的复杂微生物组中，全程氨氧化菌：硝化螺旋菌进行氨氧化过程的原位证据。
重要性：通过这项研究，作者提供了在复杂微生物组中硝化螺旋菌对生态学上氨氧化过程的第一个原位证据，并证明了在氨选择下，变形菌及酸杆菌对于13C-HCO3-高利用率。
论文ID
原名：DNA- and RNA-SIP Reveal Nitrospira spp. as Key Drivers of Nitrification in Groundwater-Fed Biofilters
译名：DNA和RNA-SIP揭示硝化螺旋菌驱动地下水生物滤池中硝化过程
期刊：mBio
IF：6.75
发表时间：2019.11
通讯作者：Arda Gülay &Barth F. Smets
作者单位：丹麦技术大学
实验设计
采集自来水厂生物滤池的过滤材料，置于冰上保存样品，其中一部分样品保存在液氮中后续提取RNA。培养实验具体处理如表1所示，并使用HCO3-和H13CO3-作为碳源对功能微生物进行标记，样品分别进行DNA和RNA提取及SIP实验。对于RNA样品，首先将提取的RNA（约650ng）与三氟乙酸铯溶液混合，初始密度1.790g / ml，使用Beckman VTi 65.2转子于20°C，38,400rpm下超速离心72h，将离心的rRNA梯度分层，每层250μl，折光法测量每个馏分的浮力密度，以区分重层和轻层，对馏分中提取rRNA进行纯化。对于DNA样品，将1.6 μg DNA溶解在最终密度约为1.725g / ml的CsCl溶液中，超速离心44h，并通过PEG沉淀回收DNA。回收后的核酸样品进行PCR扩增及测序，对于测序结果进行后续生物信息学分析。
结果
四种处理鉴定氧化氨和亚硝酸盐的微生物（表1）：（i）71μM NH4+（ii）71μM NH4+，100 μM烯丙基硫脲（ATU）（iii）71μM NO2-和（iv）71μM NH4+和1 mM NaClO3。所有处理均使用含有100％13C标记或100％未标记的碳酸氢盐的进样液运行15天，比色法分析NH4+和NO2-浓度，计算出NH4+的去除率（％）。
1号（H13CO3-）和2号柱（HCO3-）中，模拟了满量程条件，目的是阐明与硝化有关的完整的食物网。3号（HCO3-）和4号（H13CO3-）中，加入烯丙基硫脲用于抑制细菌氨氧化，同时加入与1号和2号处理相同的NH4+。在8至86μM的烯丙基硫脲浓度下，烯丙基硫脲完全抑制细菌氨氧化，而古细菌氨氧化对烯丙基硫脲的敏感性较低。AOB中烯丙基硫脲抑制的机制被认为是AMO酶中活性位点与Cu2+螯合。为了确定与亚硝酸盐氧化有关的微生物，添加NO2-至5号（H13CO3-）和6号柱（HCO3-）。在8号（H13CO3-）和7号（HCO3-）中加入ClO3-抑制在NH4+存在的情况下亚硝酸盐的氧化，目的是鉴定仅与NH4+氧化相关的类群。
表1 :实验设计13C，底物利用率和积累水平以及测序样品描述
生理活性：在71μMNH4+处理中，未添加抑制剂可以全部去除NH4+（99％），而使用烯丙基硫脲处理后NH4+去除范围为11％至19％，NH4+，NH4+-ATU和NO2-的柱子都具有较高水平的NO2-去除率，在1μM ClO3-柱子中，NH4+的去除受到抑制（6％至11％）（Table1）。根据进水和出水NH4+，NO2-和NO3-的浓度来调节氮的质量平衡，从而最大程度地减少额外的氮循环的可能性。
1 DNA-和RNA-SIP中检测13C标记的微生物分类单元
从实验结束时采集的样本中提取DNA和RNA进行密度梯度离心，分离和16S rRNA基因扩增并测序，99%相似性进行聚类，并通过比较HCO3-和H13CO3-不同处理中各个OTU的相对丰度和所有馏分中的浮力密度，确定所有处理中OTU中13C的标记情况。
在仅添加NH4+的处理中，13C标记的OTU与α，β和γ变形杆菌，硝化螺旋菌，放线菌，匿杆菌和酸杆菌的17个属有关。其中，硝化螺旋菌的13C利用率最高（DNA-SIP和RNA-SIP分别为32％和1.1％），相对丰度最高（26％）。亚硝化单胞菌也被标记，但显示出低水平的13C利用率（DNA-SIP和RNA-SIP分别为0.07％和0.8％），并且相对丰度较低（总DNA和RNA分别为0.15％和0.18％）。标记的rRNA均匀地分布在5个不同的属之间，包括Woodsholea、Blastocatella、Acidobacteria subgroup 10、Pedomicrobium和Sphingomonas。
尽管在NH4+-ATU处理的色谱柱中氨氧化被严重抑制（fig 1），但15个属的OTU被13C标记。在NH4+-ATU中，硝化螺旋菌（10％DNA-SIP，4.7％RNA-SIP），假单胞菌（3％DNA-SIP，1％RNA-SIP），甲基球菌（2.7％DNA-SIP，2.6％RNA-SIP）和Blastocatella（2.6％DNA-SIP，3.1％RNA-SIP），而Sphingomonas（1.8％）和Woodsholea（1.4％）在总RNA库中占主导地位。
在NO2-处理中，分别为Alphaproteobacteria（10％DNA-SIP，23％RNA-SIP），Deltaproteobacteria（1％DNA-SIP，21％RNA-SIP）和Gammaproteobacteria（6％DNA-SIP，11％RNA-SIP），硝化螺旋菌（71％DNA-SIP，15％RNA-SIP），放线菌（3％DNA-SIP，7％RNA-SIP），Latescibacteria（0.5％DNA-SIP，5％RNA-SIP）和Acidobacteria（6％DNA-SIP，11％RNA-SIP）被标记。硝化螺旋菌被标记的OTU数量最多（总共96个），并且吸收了大部分H13CO3-，对比4-6号处理，仅保留Nitrospira OTU，因此被确定为唯一的亚硝酸盐氧化活性微生物。
假说：硝化螺旋菌是一种活性氨氧化微生物，作者将NH4+和NO2-的处理中检测到的标记硝化螺旋菌OTU之间进行比较（fig. 1a），假设在NH4+处理中标记的硝化螺旋菌OTU会同时包括氨氧化和亚硝酸盐氧化的硝化螺旋菌，而NO2-处理排除进行氨氧化的硝化螺旋菌，热图展示标记的硝化螺旋菌OTU（fig. 1b），在NH4+处理中，在RNA和DNA水平上分别标记了8个（24％）和70（51％）OTU，这表明有几种硝化螺旋菌积极吸收H13CO3-。
根据在NH4+和NO2-的处理中13C标记情况，确定硝化螺旋菌78种（RNA-SIP鉴定8种，DNA-SIP鉴定70种）硝化螺旋菌（99％16S rRNA序列相似性）进行全程氨氧化，96种（RNA-SIP鉴定25种，DNA-SIP鉴定71种）硝化螺旋菌执行亚硝酸盐氧化过程, 硝化螺旋菌谱系Ⅱ在生物滤池群落中主导氨氧化过程（fig. 1c）。
图1. a. 确定氨氧化和亚硝酸盐氧化硝化螺旋菌的方法。b. NH4+和NO2-的处理中所有带标记的Nitrospira OTU c. 所有标记的硝化螺旋菌OTU基于16S rRNA的系统树，空心和实心三角形分别代表由RNA-SIP和DNA-SIP鉴定，Comammox Nitrospira序列用实心圆圈表示。
2 存在其他细菌同化利用H13CO3−
作者发现一些类群在RNA-SIP和DNA-SIP中也被13C标记（fig. 2 left），并且相对丰度发生明显变化（fig. 3c），但只有硝化螺旋菌同时与氨和亚硝酸盐氧化有关，并且只有硝化螺旋菌与亚硝酸盐氧化有关（fig. 2 right）。在存在NH4+的处理中，H13CO3-掺入类群中与Nitrosomonas相比，其中Acidobacteria-subgroup10、Nitrospira (Nitrospira)、Pedomicrobium (Alphaproteobacteria)、Rhizobacter和Acidovorax (Betaproteobacteria)相对丰度的变化更高（fig. 3c）。
实验过程中Acidobacteria subgroup10、Pedomicrobium、Rhizobacter和Acidovorax这些分类单元的DNA和RNA相对丰度也比Nitrosomonas和 Nitrospira大得多（fig. 3c）。大多数异养微生物可以通过羧化反应参与CO2同化作用，然而过早代谢微生物的CO2吸收通常仅导致异养生物吸收3％至8％的细胞碳，这不足以通过DNA-SIP进行标记检测。因此相对于已知的氨氧化微生物，异养碳同化不能解释更大程度的H13CO3-掺入，并且与亚硝化单胞菌和硝化螺旋菌相比，观察到的13C标记的属具有较高的浮力密度变化和较高的DNA和RNA丰度变化（fig. 2，3）。
图3. a. 鉴定氨氧化微生物和亚硝酸盐氧化微生物 b. 不同处理下活性微生物 c. DNA和RNA中假定氨氧化微生物的相对丰度变化情况。
讨论
稳定同位素标记技术SIP曾被用于鉴定沉积物和土壤中的活性硝化微生物，在大多数研究中，单独使用DNA-SIP或RNA-SIP，但二者对于识别关键微生物都很重要。当DNA-SIP检测到同位素掺入到分裂细胞中时，RNA-SIP可以检测到活跃的但缓慢生长或不生长的细胞。通过将SIP与下一代测序技术（NGS）结合，可以提高生物分类学的分辨率，并以高度的微多样性提高了分类单元中的系统型。作者研究了使用RNA-和DNA-SIP在RGSF中的H13CO3-的同化与硝化作用，并提供了硝化螺旋菌对与生态相关NH4+氧化的第一个原位生理证据。
先前的研究表明，硝化螺旋菌硝化螺菌比硝化单胞菌丰度更高，并且发现硝化螺旋菌在一个完整的快速重力滤砂器RGSF微生物组中具有完整的硝化途径。硝化螺旋菌是在NH4+和NO2-的处理中唯一利用H13CO3-的属，表明硝化螺旋菌是该系统中唯一氧化环境NH4+和NO2-的属，在系统发育上比较了硝化螺旋菌的氨和亚硝酸盐氧化系统型。在本研究中，尽管存在氨氧化古菌（AOAs），但其含量远低于硝化螺旋菌（100-1,000倍），但没有任何古细菌类群被13C标记，这可能是由于它们的初始丰度低或在实验过程中施加了较高的NH4+浓度，因为AOA在能量供应减少的条件下可以更好地成长。
评论
本研究通过培养实验，并使用DNA-和RNA-SIP中检测13C标记的微生物分类单元评估了在地下水生物滤池中执行硝化过程的活性微生物分类组成及相对丰度变化情况。通过这项研究，作者提供了在复杂微生物组中硝化螺旋菌对生态学上氨氧化的第一个原位证据，并证明了在氨选择下，变形菌及酸杆菌对于13C-HCO3-高利用率。此外，稳定性同位素标记技术（SIP）结合DNA和RNA核酸样品用于鉴定功能活性微生物，提供了重要的研究技术手段。
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