科研 | Gut：16SrRNA扩增子测序和代谢组共同揭示原发性硬化性胆管炎患者胆汁微生物群的变化
编译：莫沉，编辑：小菌菌、江舜尧。
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原发性硬化性胆管炎(primarysclerosing cholangitis, PSC)是一种原因不明的胆汁淤积性肝病，其特征是胆管的进行性纤维化狭窄和胆管粘膜的溃疡性病变。目前，相关研究报道发现，与健康对照组相比，原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)患者的结肠微生物群发生了改变。然而，对于PSC中胆管微生物群及其与胆汁酸代谢的相互作用知之甚少。利用高效液相色谱-质谱测定胆汁中胆汁酸组成，并在外部队列(n=20)中进行验证。胆汁含有不同于口腔、十二指肠液和十二指肠粘膜群落的多种微生物群。该研究发现，PSC患者与对照组的上消化道中菌群存在差异。然而，PSC患者与对照组在胆汁中的差异最大，包括PSC中微生物多样性降低和Enterococcus faecalis增加。胆汁中Enterococcus abundance丰度与次级胆汁酸牛磺胆酸浓度呈显著正相关。上述结果表明，PSC的特征是上消化道和胆管的菌群发生显著改变，胆道菌群的失调与促炎和潜在致癌剂牛磺酸石胆酸浓度增加有关。
论文ID
原名：Alterations of the bile microbiome in primary sclerosing cholangitis
译名：原发性硬化性胆管炎患者胆汁微生物群的变化
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2019.6.26
通讯作者：Christoph Schramm
通讯作者单位：汉堡-埃彭多夫大学医学中心, 医学系和Martin Zeitz罕见病研究中心
实验设计
所有PSC患者和对照组均在汉堡-埃彭多夫大学医学中心招募。根据最新的指南，PSC的诊断是基于胆道造影、肝活检(如果可能)和排除硬化性胆管炎的次要原因的典型胆道病变的存在。其中，排除标准为ERC指数为急性细菌性胆管炎，过去12个月内有ERC史，患者年龄<18岁，严重的内科合并症，小管PSC和继发性硬化性胆管炎的任何证据。此外，患者被要求在ERC之前的6个月内没有接受任何抗生素治疗，因为这段时间间隔预计足以在抗生素治疗后恢复广泛的菌群结构。在本研究中，总共有65名患者符合分析条件(PSC：n=43，对照组：n=22)。表1提供了详细的患者临床信息描述。PSC患者ERC的适应症包括胆汁淤积或MRI怀疑显性狭窄。在对照组中，PSC被胆道造影和临床随访排除。
表1 病人的临床特征。*根据临床体征、影像学、瞬态弹性成像和活检(如有)诊断肝硬化；†所有对照受试者均接受胆道梗阻的首次诊断；‡所有接受UDCA治疗的PSC患者每日的剂量为15-20 mg/kg；
由于尚不清楚所研究的任何上消化道部位的微生物生态是否与胆汁微生物群相似，我们首先通过使用Bray-Curtis距离对主坐标进行约束分析来检查口腔、十二指肠液、十二指肠粘膜和胆汁之间微生物群落结构的差异(图1A，B)。接着研究者探讨了在门水平上的群落结构，发现只有5个门几乎占了所有部位的整个微生物群落，分别是Actinobacteria,Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria以及Proteobacteria。将PSC患者与对照组进行比较，我们观察到口腔和十二指肠部位的菌群丰度没有显著差异(p>0.05)。关于导管胆汁菌群，Proteobacteria显示PSC患者与对照组相比显著增加(p=0.0384；图1C)。PSC患者的胆汁中其他菌群显示出与对照组相似的丰度(分别为p>0.1)。由于健康对照胆汁核心菌群的基线结构尚不清楚，因此，研究者在属分类水平上调查了对照队列和PSC患者的胆汁核心菌群结构谱。两组之间都有不同的核心微生物群，以Streptococcus为优势属(图1D)。然而，PSC患者表现出核心微生物组的丰富度降低，表现为相对丰富度>0.1%的属的比例降低，上述结果突出了PSC与健康状态下稳定的核心胆汁微生物组成的偏差(图1D)。
图1 (A)对照组和 (B)PSC患者的口腔(n=65)，十二指肠液(n=65)，十二指肠粘膜(n=65)和胆汁(n=65)之间的β差异，通过对Bray-Curtis距离的主坐标的约束分析；(C)代表各个身体部位的不同门类相对丰度的柱状图。与对照组相比，PSC患者胆汁样品中的Proteobacteria有统计学意义的增加(p=0.0384)。(D)属水平胆汁液群落的核心菌群分析。热图显示各属阳性患者的百分比(颜色梯度1=100%；n=65例)。x轴列出在给定相对丰度(y轴；检测阈值；0.1=10%)下发现的分类单元名称。PSC患者表现出较少的多样化的核心成分和在对照患者中发现的许多核心分类群的下降。
2 PSC患者中上消化道和胆道分泌液微生物群的改变
研究者比较了PSC患者和对照组在不同身体部位的样本内α多样性。与对照组相比，PSC患者胆汁微生物群落的α多样性降低(p=0.0127；图2A)。α多样性在其他部位未观察到显著差异，表明PSC中胆道微生物群的变化比其他上消化道群落严重。我们观察到PSC患者和对照组在口腔、十二指肠液和胆管液中的整体群落结构(β多样性)有显著差异(p≤0.01；图2B)，并且十二指肠粘膜上的群落有不同的趋势(p=0.064)。接下来，研究者试图在PSC患者和对照组之间在较低的分类层次水平(属和种)上识别差异丰富的细菌。与对照组相比，PSC患者的胆道中在单个分类群水平上显示出最广泛的差异(图2C)。Enterococcus增长最快，其次是Staphylococcus。在其他细菌中，Neisseria在PSC患者中也显著富集。关于胆汁种类的不同丰度(图2C)，Enterococcus faecalis在PSC患者中表现出最强的增加，其次是Veillonelladispar。
图2 (A)Shannonα多样性指数，按诊断和身体部位分层。只有胆汁中菌群在PSC中显示出显著降低的α多样性(p=0.0127)；(B)PSC患者与对照组在不同体格中微生物β多样性的差异。通过使用Bray-Curtis距离对主坐标进行分析来可视化β多样性。(C)被确定为PSC患者和对照组在胆汁中差异丰富的单个分类群。对数2倍变化表现为属和种水平的差异丰度。正的log2倍变化表明PSC中的丰度增加。NS，不显着；PFDR，p值校正为假发现率；PSC，原发性硬化性胆管炎。
3 PSC患者胆汁微生物群代谢功能的改变
图3 (A)显示胆汁中差异丰富的微生物代谢途径的热图。仅显示在FDR<0.05时具有显著差异的路径。每一列代表一个单独的PSC患者。颜色代码表示计量测试统计量和统计意义上差异丰度的方向(红色表示过度表示，蓝色信号表示不足)。(B)PSC患者与对照组之间胆汁中胆汁酸浓度的比较。除TLCA外，PSC患者的大多数胆汁酸浓度均降低。(C)显示PSC患者胆汁细菌属和胆汁酸之间的部分相关系数的热图。根据性别、体重指数、碱性磷酸酶水平和瞬时弹性成像测量(肝纤维化的代用指标)计算部分相关性。另外，仅对于统计上的显著相关性，才以数字形式显示系数。我们观察到Enterococcus和TLCA之间有很强的统计意义的相关性(p=0.0021)。
结论
评论
PSC是一种主要影响胆管的疾病，胆管代表着体内巨大的粘膜屏障。微生物群的改变可能会显著增加与PSC相关的非遗传风险。在本研究中，研究者检测了PSC患者和对照组之间口腔、十二指肠和胆管胆汁中的微生物组成的差异。除了先前报道的PSC中粪便和结肠粘膜微生物群的变化外，该研究还首次表明PSC患者的上消化道和胆管也同样受到微生物失调的影响。此外，PSC与IBD的独特表型密切相关。PSC患者死亡率增加，主要是由于胆管癌、胆囊癌及肠癌的风险增加，肝脏移植是唯一可用的治疗选择。PSC的发病机制尚不清楚。遗传学研究认为，PSC是一种自身免疫性疾病，但男性优势和对免疫抑制的不良反应使其不同于典型的自身免疫性疾病。多项研究证据表明，共生细菌群落是PSC病理生理学的关键参与者。最近的测序研究显示PSC患者的肠道菌群发生了改变，无论是在粪便水平还是粘膜水平，这与健康人和UC患者都不同。在NGS出现之前，健康的人类胆汁一直被广泛认为是无菌的。尽管如此，早期基于培养的研究表明，存在于胆汁中辅助性Th17型免疫应答的细菌与PSC的临床结果有关。最近的一项NGS研究表明，PSC患者和没有硬化性胆管炎的对照组都存在不同的胆汁微生物群。胆汁酸被认为在PSC的发病机制中起着至关重要的作用，尽管PSC患者本身缺乏“有毒”胆汁成分的证据。由于初级胆汁酸胆酸和鹅去氧胆酸转化为次级和潜在毒性胆汁酸脱氧胆酸和石胆酸被认为主要是由细菌肠道微生物群驱动的，因此微生物失调预计将对PSC中的胆汁酸池和粘膜稳态产生深远的影响。然而，目前针对胆汁酸和胆汁中菌群之间的联系到目前为止还没有被深入地研究过。在本研究中，研究者针对接受了内镜逆行胆道造影(ERC)的PSC患者和对照组的上消化道和胆管胆汁的菌群，同时分析了各个队列的胆汁酸代谢图谱，从而系统地分析胆汁细菌和PSC中胆汁酸之间的潜在相互作用。
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