哺乳动物细胞灌流培养工艺开发与优化
哺乳动物细胞具有和人类相似的复杂翻译后修饰，常被用来表达具有活性的生物大分子蛋白。而这些生物大分子的功能发挥在一定程度上依赖于这些翻译后修饰。3T3，BHK，293，CHO，NS0，Hela等细胞均被研究并用作生物大分子蛋白的表达，但是有近70%已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的，CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。这主要得益于CHO细胞的以下一些特点：1）具有和人类似的翻译后修饰；2）清晰的历史背景和监管机构的认可；3）较少的分泌性内源蛋白；4）在无血清及化学限定培养基中快速稳健的悬浮生长；5）病毒安全性; 6) 四十多年来积累的知识和经验。随着近些年在细胞工程及细胞培养基以及工艺开发方面的显著进展，CHO细胞的表达量获得了非常显著的提高。
哺乳动物细胞体外培养较之传统的微生物细胞培养难度较大，主要是由于哺乳动物细胞倍增时间长、代谢途径复杂、对外界环境敏感性强、对营养要求苛刻，且培养过程中细胞状态容易改变。目前常用的哺乳动物细胞培养工艺有：批次培养、补料批次培养和灌流培养 。
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工艺模式 |
优点 |
缺点 |
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批次培养 |
操作简单，污染风险小 |
峰值活细胞密度低，培养时间短，产率低 |
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补料批次培养 |
操作简单，培养时间长，产率高 |
峰值活细胞密度低 |
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灌流培养 |
培养时间长，成本低，高产优质 |
操作复杂，需要专用设备 |
CSPR (Cell specific perfusion rate）指单位细胞单位时间内灌流到的新鲜培养基体积，其相应的计算公式为：CSPR=PR/VCD×1000 。式中，CSPR：细胞比灌流速率 (pL/(cell·d))；PR：perfusion rate，灌流速率 (vvd, L/(L·d))；VCD：viable cell density，活细胞密度 (106 cells/mL)。CSPR 代表了培养过程中每天给到每个细胞的新鲜培养基体积，反映了灌流提供给细胞的营养水平，并不代表细胞自身的代谢状态。CSPR作为连接PR和VCD的桥梁，在灌流培养工艺的开发和优化过程中具有较高的指导价值，对其优化的方向是尽可能降低CSPR值的大小。这主要出于两方 面的考虑：① 减少新鲜培养基的供应，降低生产成本 (包括培养基自身及存储设备的成本)；② 降低收获液总体积，同时提高收获液中目的产物浓度，减轻下游纯化压力。基于这两点考虑，CSPR 建议尽可能控至低于 50 pL/cell·d。
结合CSPR的定义，对其优化的方法主要有两大类：①降低 PR；②提高目标VCD。但在实际操作过程中，各参数并不是可以无限调节的，应综合考虑其对培养过程的影响。PR过低则：a) 不足以供给细胞生长最低的营养需求和及时带走代谢废物，导致细胞生长受限、活率下降；b) 目的产物在反应罐中滞留时间较长，有降解风险 (尤其是不稳定的产物，如 FVIII)。PR过高则：a) 细胞对培养基养分利用不充分，造成原料的浪费，提高生产成本；b) 收获液目的产物浓度较低，下游纯化压力较大。VCD过低则：该培养体系的时空产率较低 (Space-time yield，STY，g/(L·d))，生产成本高；VCD过高则：培养液粘度过高，细胞截留装置及供氧等设备不足以维持工艺正常运行。
降低CSPR的相关方法在文献中有诸多报道。其中 Konstantinov 等提出了“push-to-low”策略， 该策略指在灌流培养的稳定阶段通过调节PR或VCD来逐步降低CSPR，直到寻找到CSPR的最小值，具体表现为更低的CSPR将导致细胞比生长速率 (μ)、存活率 (Viability) 及比生产速率 (Qp) 等的下降。Lin等在对培养基进行浓缩优化的基础上结合“push-to-low”的策略，为其所培养的CHO细胞株锁定到了最小的CSPR为75pL/cell·d，并将其成功放大至100L的生产规模。Hiller等在 CHO细胞生长阶段将灌流泵关联 pH控制上，细胞在缺乏碳源情况下消耗乳酸使pH升高从而触发灌流的运行，提出了细胞按营养需求自主调控PR的灌流策略，整个灌流过程将CSPR成功控制于20–40pL/cell·d 之间。Gagnon 等则提出在前期CHO细胞生长阶段使用相对较高的CSPR， 促使细胞快速生长至目标VCD，随之切换为浓缩的培养基以较低的CSPR继续灌流培养，这一策略减少了培养基的总用量并且方便了下游对目的产物的连续收获及纯化。
灌流培养工艺较传统的批次培养工艺，最显著的特点是为细胞提供一个稳定且有利的生长环境，这主要得益于在培养过程中维持各个培养参数的稳定，这些参数主要包括各营养物质的浓度及细胞密度。其中恒定细胞密度的维持需要结合细胞的生 长速率适当放流掉一定数量的细胞，在灌流培养的稳定阶段放流速率应等于细胞的比生长速率。细胞生长越快，则需要放流的培养液量也越多，随之带来的问题是目的产物随着放流液的流失，导致 产物收率降低。因此，在灌流培养工艺的稳定阶段，一方面需要维持细胞密度足够高以确保较高的目的产物时空产率，另一方面也应当朝着降低放流速率的方向优化，进一步提高产物收率，比较理想的放流速率应控制为占总灌流速率的 5%–10%。
降低放流速率的基本原则是通过营养限制或环境限制为细胞提供次优的生长条件，以降低细胞的生长速率。通常将细胞分裂滞留于G0/G1期，该阶段为细胞分裂的准备时间，细胞代谢旺盛，包括目的产物的合成。Park等从一系列化学物质中筛选出戊酸在抑制CHO细胞生长、提高细胞比生产速率上最具有优势。Wolf 等则对比了戊酸与降低培养温度对CHO细胞表现的影响，并发现在加入1mmol/L戊酸的实验条件下， CHO细胞先是较对照组 (36.5 ℃，不添加戊酸)表现出了更低的生长速率，但在培养第 8 天以后， 细胞生长速率又逐渐回升。而较低培养温度(33.0℃)的实验组在整个培养过程中细胞生长速率都维持在较低水平，显著降低了细胞的放流速率，较对照组提升了目的蛋白收率高达15%。在实际生产过程中，适当降低培养温度确实是抑制细胞生长、提高细胞比生产速率的常用方法，但针对不同的克隆，其最适的降温后培养温度并不完全一样，因此在实际生产中还需结合实际情况寻找较为合适的培养温度。
随着灌流培养工艺的开发，近年来也发展起浓 缩补料批次培养 (Concentrated fed-batch，CFB)[23] 的新型培养方式，其在连续培养过程中不控制稳态 环境，无需放流，通过提高工艺过程中的峰值 VCD (Peak VCD)和 IVCD (Integrated viable cell density)， 进而在短时间内获得了极高的目的产物产量。较传 统的灌流培养工艺，该类新型工艺培养周期较短， 但时空产率得到了显著提升，在成本节约上具有显 著优势，有望在生物药物生产中推广使用。
提高培养体系的时空产率、降低药物生产成本，是细胞培养研究人员一以贯之的目标。决定高的时空产率的主要因素有：高的细胞密度；高的Qp；长的可培养周期(往往取决于高细胞密度情况下高细胞活率的维持)。相应的，从细胞株自身出发，可以通过细胞构建和克隆筛选获得生长优异、代谢优良、产量可观的细胞株作为生产用细胞株。从细胞培养工艺出发，则可以针对不同的克隆筛选出最适宜的培养基，同时在培养过程中做好参数控制和调节，如温度、溶氧、pH等。
传统的批次培养过程中，常在细胞生长对数晚期适当降低培养温度以促进细胞产能的提升，Wolf 等采用CHO细胞株，在灌流工艺中同样尝试在目标细胞密度下为细胞提供较低的培养温度 (33.0℃) ，发现较培养温度为36.5℃的条件，细胞Qp得到显著提升。Qin 等在CH 细胞灌流培养的稳定阶段使用氯化钠提高培养体系的渗透压，成功提高了培养体系时空产率，并且降低了产物的多聚体和酸性电荷异质体。Kuiper 等对现有用于补料批次培养的基础培养基和一定比例的补料培养基进行搭配混合，使用批次培养的摇管模型进行初步筛选，并在1L生物反应器的规模下，使用灌流工艺培养CHO细胞，对筛选结果进行验证，发现合适比例的混合培养基能够在灌流培养中获得高的细胞密度及高的目的产物产量。
为了保证灌流过程中目的产物及时收获的同时不造成所培养悬浮细胞的损失，细胞截留装置自然成为了必不可少的基本要素之一。随着哺乳动物细胞灌流培养技术的发展，细胞截留设备也同样经历着不断的变革与创新，这其中不变的宗旨是在对细胞损伤较小的情况下，有效地实现细胞的截留和目的产物的滤过，这也是灌流工艺开发的重点所在。
相比之下，基于中空纤维柱过滤原理而设计的截留装置，因其对细胞截留率高、支持培养细胞密度高且设备简单、操作方便及易于放大等优点，在目前动物细胞灌流培养中使用最为广泛。目前常用的基于中空纤维柱过滤原理而开发的细胞截留装置主要有切向流过滤 (Tangential flow filtration， TFF) 模式和交替式切向流(Alternating tangential flow，ATF) 模式。相比于TFF，ATF用隔膜泵代替蠕动泵，减少了系统对细胞的剪切力，同时由于隔膜泵周期性的凹凸运动，使得培养液在中空纤维柱中交替往复流动，由此产生的反向冲刷作用一定程度上减慢了柱子堵塞的速度，因此在灌流培养工艺中ATF更受青睐。
由于灌流工艺较高的细胞密度和较长的培养周期，收获过程中往往会观测到中空纤维柱滤膜堵塞 (Retention，R) 的现象，具体表现为目的产物在罐内累积而收获液中目的产物浓度降低。相应的，中空纤维柱在t时刻堵塞程度可以表示为：R=(Titerbioreactor–Titerharvest)/Titerbioreactor×100。 式中，R为中空纤维柱滤膜堵塞程度(%)；Titerbioreactor为t时刻罐内蛋白产物浓度(mg/L)；Titerharvest为t时刻罐内蛋白产物浓度(mg/L)。在培养过程中，滤膜堵塞为不可逆的过程，随着培养周期的延长，柱子对目的产物的截留渐趋严重，并最终因过低的目的产物收率及难以维持的收获液流速而不得不更换柱子或终止培养。滤膜堵塞相应带来的问题有：①目的产物收率降低， 增加生产成本；②目的产物截留于罐内时间过久，影响产物质量；③更换柱子增加操作的复杂性及染菌风险。基于这些考虑，分析培养过程中引起滤膜堵塞的因素，并进一步寻找可以减缓滤膜堵塞速率的措施是研究相关问题的主要方向。
目前业界普遍接受的滤膜使用过程中堵塞模型主要有4种，分别为：(A)滤孔口完全堵塞；(B) 滤孔口部分堵塞；(C) 滤孔内部黏附微粒；(D)滤膜表面形成滤饼。
影响滤膜堵塞的因素可以概括分为两大类：①生物方面，主要指培养过程产生的可以引起滤膜堵塞的微粒物质，如细胞密度、细胞活率、消泡剂添加量、目的产物浓度及培养基组成等。②物理方面，主要包括培养过程中影响滤膜堵塞速率的参数设置，如收获液过滤速率(单位膜面积单位时间内收 获的液体量，L/(m2 ·h)) 及隔膜泵充气和抽真空速率 (Pressure and exhaust，P/E flow，L/min)。
寻求减缓甚至避免产物截留的措施，进而提高工艺的稳健性并提高目的产物收率、降低生物药物的生产成本一直是业界努力的目标。Mercille等从减少堵塞滤膜微粒总含量出发，指出可以通过在SP2/0细胞培养过程中，将培养基中加入DNase Ⅰ以降低滤膜堵塞速率。但培养体系中所引入生物试剂的残留检测会是药物质量把关中不得不面对的新问题。Wang等从中空纤维柱自身特性出发，以CHO细胞株展开实验，提出可以使用较大孔径 (如 5μm) 的中空纤维柱以降低滤膜堵塞速率。但近年来将反应器灌流培养与下游纯化工艺相结合的连续操作正逐渐兴起，更推荐使用0.20μm孔径的中空纤维柱，可以省去下游深层过滤操作，提高工作效率，节约生产成本。
基于哺乳动物细胞灌流培养工艺单位工作体积高产量、高质量、低成本的显著优势，近年来随着生物药物市场的逐步扩大，工业界和学术界普遍关注灌流工艺的开发和优化，FDA 也极大地鼓励生物药物生产工艺由传统的批次培养转型到灌流培养。
但灌流培养工艺的开发仍面临其他挑战：①成熟的小体积模型 (Scale-down model) 的开发。优良的小体积模型的开发，可以在优化工艺时降低生产成本，提高筛选效率。现提出灌流培养的小体积模型有深孔板和摇管等，此类模型不能完全模拟实际生产过程中连续换液和连续收获的操作，不能很好地反馈目的产物收获时对中空纤维柱滤膜的堵塞作用，此类模型也没有pH和溶解氧 (Dissolved oxygen，DO) 的实时控制，并不能完全模拟灌流培养中细胞的生长和代谢状态，作用较局限。②目的产物关键质量属性调控方法的开发。糖型和电荷等的变化均会影响蛋白类药物的有效性及在体内的免疫原性，尤其是在生物类似药的研发和申报时，对质量的调控显得更为重要。然而目前关于调节产物质量的文献报道多是基于传统的批次培养工艺，针对培养模式和细胞代谢状态有别的灌流培养工艺，开发出特有的更有效的调节质量策略仍需投入时间和精力。③ “亚批次”收获产物之间质量一致性的保证。灌流培养工艺周期较长 (一般>30d)，培养期间目的产物连续收获。尽管认为灌流培养细胞生活环境处于稳定状态，但随着细胞倍增次数的增高，细胞代谢状态可能发生改变，进而影响到目的产物质量的一致性，而该问题是药物临床研究申请不得不面对的关键问题。因此，实现传统批次培养到连续灌流培养的完全转型，仍有较长的路要走。
参考文献：