观察 | 浅析ddPCR在肿瘤早筛中的应用
微滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)作为第三代PCR，是近年来分子生物学领域的新型革命性技术之一，可以对核酸分子进行绝对定量。不需要阳性对照，不再依赖标准曲线，相比前两代PCR，结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。
ddPCR的特性决定其特别适合痕量、不易得到的待检样品，适合基质复杂样品的检测，不依赖Ct值，也不依赖扩增效率，从而使得ddPCR可有效适用于肿瘤的早期筛查，在肺癌和乳腺癌患者病情的实时动态监测方面已有非常好的应用案例。
什么是ddPCR
ddPCR系统利用油包水技术，在传统的PCR扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，将此反应体系分割为成千上万个微滴，即成千上万个独立的PCR反应体系。在此过程中，样品被稀释至单分子水平，并被平均分配到这几万个反应体系中，每个微滴中不含或者含有至少一个待检测的核酸靶分子，这样也相当于变相的对靶基因进行富集。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定，ddPCR在扩增完成后，对每个微滴进行逐一检测，采集荧光信号，有荧光信号的微滴判读为“1”，没有荧光信号的微滴判读为“0”，而后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现对最初反应体系中核酸靶分子数的绝对定量。
图1. 油包水技术——将样本分成纳升大小的样品并封装成油滴
ddPCR将样品分隔在不同的反应体系中，有效避免了反应过程中不同引物或产物间的相互杂交以及同产物间的竞争抑制，能够实现不同模板的同时扩增，也能得到较高的扩增效率。此外，由于ddPCR的反应特点，所需样本量极少，单DNA模板出现在单个微滴体系中而未被检出的可能性非常低，比起第二代的qPCR来说是一个巨大的进步。ddPCR直接对目标分子进行计数而不依靠任何阳性对照或外标，避免了qPCR中样品扩增效率可能与校准物扩增效率不同的问题，同时也不再需要标准曲线。由于以上这些特点，ddPCR在检测领域有着多种不可替代的优势，尤其适用于微量或痕量DNA检测与定量，并且使用灵活，可以按照实验需要调整通量和灵敏度。
图2. ddPCR的不同目标分子浓度反应结果示意
ddPCR与肿瘤早筛相关的应用
肿瘤形成的早期阶段会发生肿瘤细胞的坏死和凋亡，这些坏死或凋亡的肿瘤细胞会释放DNA进入外周血形成血浆或血清游离DNA；增殖旺盛的肿瘤细胞也能持续释放DNA进入血液循环。因此，可以通过对血清游离的DNA进行检测从而达到对肿瘤的早期筛查，除此之外还可以通过检测循环肿瘤细胞、外泌体及RNA等来实现肿瘤早筛。ddPCR在肿瘤早筛中主要应用于针对血清游离DNA 的检测，有以下这些方面相关的应用。
低丰度及稀有序列的精确定量：在野生型DNA 的背景下，癌症相关突变基因浓度很低，往往逃过检测，目前对于低丰度目标序列的检测，由于背景DNA的干扰存在，定量PCR、杂交、毛细管测序及NGS等方法都达不到精细定量的要求。相比而言，ddPCR系统可以将稀有的核酸序列从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了信噪比。此外，由于ddPCR对于抑制剂的耐受程度较高，可具体应用于很多临床样品（血液、尿液、粪便、痰液、脑脊液等）中对肿瘤核酸标记物的检测。一般而言，毛细管电泳和定量PCR的检测灵敏度约在10%；NGS的灵敏度可达到1%；而ddPCR的检测下限为0.001%。
二代测序辅助建库：ddPCR可作为一种精确的方法，用于NGS文库的质量控制，可以精确定量测序文库，还可以实现对于少量模板的有效扩增，得到更多的有效测序数据。此外，在NGS运行后，可采用ddPCR有效地对NGS的实验结果进行验证，协助如拷贝数变异（CNV）研究或无创产前筛查的检测等。CNV是人类基因组中个体差异的一个重要来源，与癌症、神经和自身免疫疾病及药物的不良反应等存在关联。已有研究报道ddPCR结合NGS检测在非小细胞肺癌的临床诊治中得到良好的效果，不仅可以对肺癌早期进行有效的确诊，也可以在患者接受临床治疗的过程中，对患者的癌细胞变化进行实时追踪。
肿瘤治疗的伴随诊断：ddPCR技术可用在对循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测上，实现肿瘤标记物的有效检测，指导用药并实时监控疾病进展。在临床多种肿瘤如非小细胞肺癌、乳腺癌和肠癌的治疗中都取得了一定的成果。与其他常规指标的变化相比，ctDNA的丰度和突变都会更早出现，虽然血液中仅有微量ctDNA，ddPCR技术也能及时的在正常体细胞DNA的干扰下检测到病人状况的变化，协助医生调整治疗方案，给患者提供更有效的治疗。
甲基化含量鉴定：现阶段的甲基化程度分析的主要手段有传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序统计法、抗体检测法、定量PCR检测法等，但由于客观条件的制约，均不能获得精确的定量。而ddPCR为甲基化程度的精确定量检测提供了一种全新的技术，可用于检测cfDNA的甲基化特征，帮助研究人员早期发现癌症，鉴别不同癌症类型特有的DNA甲基化特征。
基因表达差异研究：ddPCR实现了真正意义上的绝对定量，从而有能力实现更精确的基因差异表达研究，尤其适用于靶基因表达差异微小的情况；比如miRNA的表达分析、等位基因的不平衡表达、单细胞基因表达分析等，可检出0.01%或更少的等位基因频率的变化。在循环系统miRNA诊断领域，ddPCR能帮助进行生物标记物研究，直接比较同一实验室跨天多次试验，甚至不同实验室之间的检测结果。针对miRNA的检测中，有研究称ddPCR相比于qPCR，能提高7倍不同日期里实验室的重复率，且具有更高的可信度。
与ddPCR及肿瘤检测相关的专利情况概览
分析截止2019年4月公开的与ddPCR及肿瘤检测相关的专利，可以看到最早在2000年即有相关申请出现，从2012年开始申请量大幅增长，自此逐年快速攀升，至2016年达到高点，2017年和2018年也保持在较高的水平，由于专利公开滞后，不排除2017年和2018年的申请量事实上比2016年更高的可能性。
图3. ddPCR及肿瘤检测相关专利全球申请趋势
从申请人排名来看，此领域内申请量位于前列的公司均为国外公司，除排名第七的LifeCodexx是德国企业，排名十一的GENCURIX是韩国企业，其他的申请人均为美国企业或研究机构，排名前五的申请人更是远远领先于其他，显示这一领域内美国研发实力雄厚，走在世界前列。
图4. ddPCR及肿瘤检测申请人排名
从申请地区来看，排除WO专利，申请地区主要在美中日欧韩，这些地区也是传统的主要目标市场。
图5. 技术全球分布
从中国申请来看，中国申请人则主要来源于上海、北京、广东、江苏和浙江，说明这一技术相关的企业及研究机构主要分布在这些地区。
图6. 中国申请人分布
总体来说，ddPCR的高灵敏度，高准确度以及绝对定量的能力能够给研究人员提供更可靠的数据，在早期肿瘤检测的敏感度、准确性及癌症分类等方面都有巨大的发展潜力，将在癌症的早期预防和早期发现中发挥巨大的作用。
参考文献：
1.https://zhuanlan.zhihu.com/p/27928162
2.Taylor, Sean C., Genevieve Laperriere, and Hugo Germain. 'Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.' Scientific reports 7.1 (2017): 2409.
3.Shen, Shu Yi, et al. 'Sensitive tumour detection and classification using plasma cell-free DNA methylomes.' Nature 563.7732 (2018): 579.
4.https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-basics.html
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