科研 | JHM：在受金属污染的盐渍土壤中，植物有益细菌和丛枝菌根真菌在植物修复中的潜力
本文由艾奥里亚编译，十九、江舜尧编辑。
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植物修复技术被认为是一种很有前途的可对受污染土壤进行修复的技术。然而，气候胁迫，特别是盐分，是对土壤性质和植物生长的潜在威胁，从而限制了该技术的应用。本研究以（向日葵）Helianthus annuus为研究对象，探究了微生物接种对镍（Ni）污染盐渍化土壤修复效果的影响。微生物接种选用耐盐性植物益生菌（PBB）Pseudomonas libanensis TR1和丛枝菌根真菌（AMF）Claroideoglomus claroideum BEG210两种微生物。研究发现，单独接种接种P. libanensis或与C. claroideum共同接种显著促进植物生长，改变植株生理状况（如电解质渗漏、叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量），同样也改变了H. annuus在Ni和盐胁迫单独胁迫或联合胁迫下对Ni和钠（Na+）的积累潜力（如Ni和Na+的摄入和转运因子）。这些结果表明，微生物菌株的生物强化可以作为改善金属污染盐渍化土壤中植物修复的一种较好的方案。
论文ID
原名：Potential of plant benefificial bacteria and arbuscularmycorrhizal fungi in phytoremediation of metal-contaminatedsaline soils
译名：在受金属污染的盐渍土壤中，植物有益细菌和丛枝菌根真菌在植物修复中的潜力
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：7.65
发表时间：2019
通信作者：Ying Ma
通信作者单位：University of Coimbra
实验设计
试验所用土壤采自葡萄牙科英布拉大学植物园，土壤经烘干、研磨、分筛（2mm）后，用蒸煮（100°C，连续3d）消毒1h。灭菌后，在土壤中加入NiCl2水溶液，使最终的Ni浓度达到450 mg kg-1，并在温室内保存2周，达到金属稳定的目的。在完全随机区组设计中，将含有1公斤无菌土壤的盆栽按4×2×2因子排列，包括4个微生物处理：（i）空白；（ii）PBB P.libanensis；（iii）C. claroideum；（V）PBB+AMF；和两个金属胁迫处理：（i）对照（无应激）；（ii）金属胁迫（MS）。
细菌生长实验中，将含有20ml LB的培养瓶（250ml）加入0，3，6和9%（w/v）的NaCl，接种对数期的细菌菌株。所有培养物包括对照（分5个重复）在28℃下以200转/分孵育168小时。通过在分光度计上测量600 nm处的光密度（OD）并在8，16，24，32，73，120和168小时计数菌落形成单位（CFU）来监测细菌的生长。
实验结果
1 Pseudomonas libanensis TR1的生化性质
P. libanensis对盐度（8%）和极端温度（4-38℃）表现出较高的抗性。菌株TR1为革兰氏阴性，运动，无芽孢形成棒状，氧化酶和过氧化氢酶阳性。它能够产生吲哚，H2S，可利用L-阿拉伯糖，D-甘露醇，丙二酸和柠檬酸以及水解L-酪氨酸和尿素。此外，菌株TR1是一株较好的ACCD、IAA、铁质载体和EPS产生菌（表1）。
表1 Pseudomonas libanensis TR1的形态、生理生化特性。
2 盐胁迫下细菌生长
P. libanensis在添加NaCl（0，3，6和9%）的LB培养基中具有很大的生长潜力（图1）。细菌生长速率在对照和三种浓度的NaCl之间有所不同。在最初的24小时内，在对照处理中观察到最大的生长，其次是添加3%和6%的NaCl。与对照以及3%和6%添加量的NaCl相比，9%添加量的NaCl显着降低了细菌的生长速率。然而，在培养24小时后，NaCl添加量为9%的菌株TR1保持了与对照和3%以及6%NaCl添加量菌株之间相似的细胞密度的存活率。
图1 Pseudomonas libanensis在添加NaCl浓度的培养基中的生长规律。
3 微生物定殖
尽管存在盐胁迫（SS）和重金属胁迫（MS），但在接种两个月后，P. libanensis在H.annuus根际表现出了定殖潜力（图1）。菌株TR1表现出对SS（图1）和MS（表1）具有较高的抗性，但除了在没有AMF存在的情况下，SS对细菌定殖没有影响外，这些胁迫（单独和组合）显著减少了接种PBB和PBB+AMF的细菌在H. annuus根际的定殖（图2）。此外，与单独接种PBB相比，除了在SS胁迫下，共同接种PBB和AMF导致了所有胁迫条件下细菌数量的下降。
图2 在盐和镍胁迫下，在Helianthus annuus根中，丛枝菌根真菌（A）的根长定植百分比以及细菌在根际定植的百分比（B）。误差线代表5个重复之间的标注差。相同字母表示的各列数据在微生物处理间差异不显著（p<0.05）。
在不考虑SS、MS以及SS和MS胁迫的情况下，C. claroideum能够定殖H.annuus的根部。然而，在没有PBB的情况下，SS和MS（单独和组合）极大地降低了AMF定殖的根长百分比（%RLC）。当AMF和PBB共接种于H.annuus时，与各自的对照处理相比，SS对%RLC没有影响。此外，MS和SS+MS能够显著抑制AMF的定殖。在未接种的植物根系中没有AMF定殖。
4 植物生长与生理参数
未接种的植株在SS、MS和SS+MS下鲜重分别下降了36%、45%和58%。复合胁迫（SS+MS）对植物生长的总体影响具有叠加性，导致了胁迫效应加剧。同样，SS+MS共同胁迫显著降低了69%的植物干重，而SS或MS单独胁迫对植物生物量没有显著影响。接种微生物（PBB，AMF单独接种以及PBB和AMF共同接种）显著提高了在SS，MS和SS+MS胁迫下H.annuus的鲜重和干重（表2）。例如，在SS+MS共同胁迫下，PBB、AMF和PBB+AMF组合的植株鲜重分别增加了89%、70%和77%；干重分别增加了373%、277%和310%。在不考虑从微生物接种的前提下，除了在SS+MS共同胁迫下PBB+AMF共接种显著提高根冠干重比外，对照和胁迫处理（SS、MS和SS+MS）的根/冠干重比差异不显著。P. Libanensis和C.claroideum单独接种或共同接种导致H.annuus在各自的压力下耐盐指数（STI）和耐金属指数（MTI）上升。然而，在SS+MS共胁迫条件下植株生长的盐及金属共耐受指数（SMTI）在对照和接种的植株之间无显著差异。
表2 微生物菌剂对盐度和镍胁迫下Helianthus annuus鲜重和干重、根/枝干重比以及盐、金属、盐和金属耐受性指数的影响。5个样品的值以平均值±标准差形式表示。基于Tukey检验，相同字母标注的各数据在微生物处理之间没有显着性差异（p<0.05）。基于方差分析，***，**和*分别表示在 0.001，0.01和0.05水平上具有显著性差异，ns表示无显著差异。
电解质渗漏率（EL）测定用于评价SS和MS胁迫下对细胞膜的损伤程度。研究结果表明，暴露于SS、MS或SS+MS的未接种细菌的植株叶片，其EL增加，其中在SS和SS+MS下生长的植物中EL增加最大（图3）。未接种和单独接种AMF处理的植株之间的EL没有差异。然而，接种PBB或PBB+AMF导致生长在SS、MS和SS+MS下的植株的EL显著降低。
图3 在盐、镍胁迫下，微生物接种对Helianthus annuus电解质渗漏的影响。误差线代表5个重复之间的标注差。相同字母表示的各列数据在微生物处理间差异不显著（p<0.05）。
叶片叶绿素含量测定用于评价微生物接种（MI）、SS和MS对叶片光合作用潜力的综合影响。在没有PBB和AMF的情况下，SS或MS单独胁迫下对Chl a，Chl b，Chl a+b和Chla/b比值没有影响，但显著降低了类胡萝卜素的含量（表3）。然而，与非胁迫对照相比，在SS+MS共同胁迫下降低了Chl a，Chl a+b和类胡萝卜素的含量。与相应未接种的植株相比，接种PBB后，SS处理下植株叶片的Chl b、Chl a+b和类胡萝卜素含量分别显著增加123%、45%和67%，而Chl a/b比值降低了55%。与未接种对照相比，AMF和PBB+AMF接种极大地提高了SS胁迫下植株Chl a+b的含量，SS+MS下植株Chl a的含量。
表3 盐度和镍胁迫下Helianthus annuus叶片叶绿素含量的研究。5个样品的值以平均值±标准差形式表示。基于Tukey检验，相同字母标注的各数据在微生物处理之间没有显着性差异（p<0.05）。基于方差分析，***，**和*分别表示在 0.001，0.01和0.05水平上具有显著性差异，ns表示无显著差异。
5 生化参数
本研究测定了植物细胞中脯氨酸和丙二醛（MDA）的积累，以考察植物对SS和MS的适应性反应。在SS、MS或SS+MS胁迫下的未接种的植株脯氨酸含量显著增加，其中在SS+MS共同胁迫下的植物中观察到最大的增加量（图4）。然而，在SS、MS和SS+MS胁迫的情况下，接种PBB和PBB+AMF显著降低了H.annuus叶片中的脯氨酸含量。生长在SS、MS和SS+MS胁迫下的未接种植株的叶片MDA含量显著高于非胁迫对照，但接种PBB可显著降低氧化胁迫（图4）。例如，在SS，MS和SS+MS胁迫下，接种P. libanensis分别使植物叶片中MDA含量降低了29%，49%和51%。接种AMF的植株与未接种AMF的植株之间MDA含量没有差异，但在SS下，接种AMF的植株的MDA含量显著低于相应的未接种对照。当植物暴露于MS和SS+MS时，PBB和AMF共接种导致MDA含量下降。
图4 在盐、镍胁迫下，微生物接种对Helianthus annuus脯氨酸（A）和丙二醛浓度（B）的影响。误差线代表5个重复之间的标注差。相同字母表示的各列数据在微生物处理间差异不显著（p<0.05）。
本研究同样评估了微生物接种对H.annuus积累Ni和Na+的影响（图5）。在花园土壤中生长的植物中未检测到Ni。然而，在MS的情况下，接种PBB，AMF和PBB+AMF显著增加了植物中Ni的积累，与未接种对照相比，分别增加了82%，38%和45%。这与微生物接种所引起的Ni的转运因子（TF）的降低并不一致，例如，与未接种对照相比，接种PBB，AMF和PBB+AMF，分别显著降低了67%，50%和67%的Ni的TF。当非接种植株在MS+SS共胁迫条件下，Ni浓度显著升高（p<0.05）。然而，接种PBB、AMF和PBB+AMF显著降低了MS+SS共胁迫下植物Ni的积累，分别比未接种的对照降低了34%、28%和40%。尽管如此，单独接种PBB大大提高了Ni的TF（p<0.05）。
对照或MS处理下未接种的植株中的Na+浓度显着低于在SS或SS+MS处理下的植株中检测到的Na+浓度（图5）。与各自未接种对照相比，接种PBB和PBB+AMF大大降低了在SS和SS+MS胁迫下的植株中Na+的积累。在对照或MS条件下，未接种和接种（PBB，AMF和PBB+AMF）植株生长的Na+积累无显著差异。在SS+MS的情况下，接种PBB，AMF和PBB+AMF使Na+的TF分别显著增加了44%，56%和44%。
图5 在盐、镍胁迫下，微生物接种对Helianthus annuus对镍（A）和钠（B）摄取因子和转运因子，以及NaCl的影响。误差线代表5个重复之间的标注差。相同字母表示的各列数据在微生物处理间差异不显著（p<0.05）。
结论
研究结果表明，单独接种或与C.claroideum共同接种可以通过改善植物生长、叶绿素含量和生理状态（电解质渗漏、脯氨酸和丙二醛含量）来减轻土壤中SS、MS或SS+MS的有害影响，从而提高H.annuus对多重胁迫（SS+MS）的耐受性。在SS+MS共胁迫条件下，单独施用P. libanensis或与C.claroideum还可以通过减少Ni和Na+的吸收以降低多种胁迫的有害影响。研究结果最终表明，接种PBB，AMF或共同接种在Ni污染的盐渍土中可能具有显著的提高植物生长和植物稳定效率的潜力。然而，由于本研究是在温室控制条件下进行的，因此有必要在受金属和盐分影响的田间土壤中进行进一步研究，以利用P. libanensis或与C.claroideum作为有效的生物接种剂来改善自然生态系统中的植物稳定过程。
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