科研 | 中国农业大学SBB：土壤添加果糖可改变玉米菌丝际细菌群落结并提高磷酸酶活性
编译：王桂伟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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长期施肥使有机磷在土壤中不断累积，但有机磷不能被作物直接吸收利用。丛枝菌根（AM）真菌能与大部分作物共生，但不能产生磷酸酶，主要通过招募细菌矿化有机磷。AM真菌产生的果糖被认为是招募这些细菌的信号。作者设计了一个检测果糖是否能提高玉米菌丝际磷酸酶活性的体系。在菌丝际土壤中加入由AM真菌产生的低果糖浓度和相当于菌丝分泌的总碳浓度的高浓度果糖。
结果发现低浓度的果糖没有改变土壤中磷酸酶的活性、细菌群落结构以及能够产生磷酸酶的细菌物种。在添加高浓度果糖时，磷酸酶活性增加，这与细菌种群数量增加和细菌群落结构向专门利用果糖和葡萄糖进行能量代谢的物种（如糖化细菌）转移有关。然而细菌群落结构并没有向含有碱性磷酸酶基因的物种发生特异性的转移，因此果糖不能作为招募土壤中产磷酸酶细菌的信号，但可以作为一种能源通过改变土壤细菌群落结构来刺激磷酸酶活性。
论文ID
原名：Addition of fructose to the maize hyphosphere increases phosphatase activity by changing bacterial community structure
译名：添加果糖可改变玉米菌丝际细菌群落结构，提高磷酸酶活性
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.290
发表时间：2020.1
通讯作者：冯固
作者单位：中国农业大学资源与环境学院
实验设计
本试验开发了新型的菌丝际研究装置（图 S1）。在盆栽中埋入图 S1b所示由PVC材料制成的菌丝室，在菌丝室的顶端插入一根直径为5 mm，长50 cm的塑料管。菌丝室的顶板与一侧覆盖30 μm尼龙网以便于AM真菌菌丝生长到菌丝室而根系不能。每个菌丝室含有130 g含100 mg kg-1有机磷（植酸）的土壤，试验溶液用注射器通过菌丝室外的管道注射到尼龙网顶部，然后均匀地渗透到菌丝室土壤中。
图S1试验装置示意图
播种时首先在盆子里加5 kg土，将3个菌丝室水平放置到土壤表面，然后加2.5 kg土覆盖在其表面。将60g AM真菌接种物（Rhizophagusintraradices EY108，Funneliformis mosseae，MD118 and Gigaspora margarita JA101A各20 g）接种到土壤后播种6粒玉米种子，待出苗后间苗3株。在玉米播种5-8周内，每周两次向菌丝际注射20 mL无菌水或两种浓度的果糖溶液。具体试验处理为：（1）注射无菌水；（2）注射20μmol fructose kg-1 soil；（3）注射4mmol fructose kg-1 soil。玉米种植8周后收获。
结果
1不同处理磷酸酶活性、基因拷贝数和多样性指数
酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性在对照（不添加果糖）和两个果糖处理（添加20 μmol kg-1和4 mmol kg-1果糖）之间的变化趋势相同。20 μmol kg-1果糖处理与对照无显著差异(P>0.05)。在添加4 mmol kg-1果糖的处理中，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均显著高于其他两个处理（图1）。对照的16S rDNA基因拷贝数最少，随着果糖浓度的增加，16S rDNA基因拷贝数增加。对照和两个果糖处理之间ALP基因拷贝数无显著差异（表1）。对照和低浓度果糖处理间多样性指数（Chao1和Shannon）差异不显著(P>0.05)。而高浓度果糖处理的多样性指数均显著降低(表1)。
图1 不同处理菌丝室土壤磷酸酶活性
表1 对照与不同果糖浓度菌丝室土壤中的基因拷贝数和多样性指数
2 不同处理细菌群落与含碱性磷酸酶基因的细菌群落组成
对于16S rDNA测序结果，对照与两个浓度果糖处理分别有850和321个相同的OTU。两个浓度的果糖处理之间有380个相同的OUT（图2a）。对于含碱性磷酸酶基因的细菌，对照与两个浓度果糖处理分别有601和411个相同的OTU。两个浓度的果糖处理之间有493个相同的OUT（图2b）。
通过主成分分析可以发现，对照与低浓度果糖处理细菌在门水平上未分离，而高浓度果糖处理与前二者分离（图3a）。不同细菌门水平的相对丰度显示，Actinobacteria和Proteobacteria相对丰度最高，其次是Gemmatimonadetes、Saccharibacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Parcubacteria.。各门的相对丰度在对照和添低浓度果糖处理间差异不显著。而添加高浓度果糖时，糖化菌门的相对丰度从1.4-2.1%-17.8%显著提高（图3b）。在属水平上，添加不同浓度的果糖对细菌的相对丰度影响不同（表2）。
不同含ALP基因细菌门水平上相对丰度结果显示，Actinobacteria和Proteobacteria的相对丰度最高，其次是Planctomycetes、Firmicutes、Cyanobacteria 和Gemmatimonadetes（图4）。对照与低浓度果糖处理间含ALP基因细菌门水平上相对丰度无显著差异。高浓度果糖处理Proteobacteria相对丰度由18.6- 20.0%-15.1%显著降低（图4b），Planctomycetes相对丰度由3.9-4.2%-5.9%显著增加（图4c）。
图2 不同处理细菌和含碱性磷酸酶细菌维恩图
图3 细菌门水平主成分分析与相对丰度
表2 细菌属水平上的相对丰度
图4 门水平上含碱性磷酸酶基因细菌相对丰度
3 不同处理细菌的功能预测
利用16SrDNA测序数据，利用PICRUST预测细菌不同代谢途径的丰度。低浓度果糖处理与对照相比差异不显著（P>0.05）。但添加高浓度果糖对某些代谢途径有显著影响：显著促进核苷酸代谢、辅因子和维生素代谢、能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢；显著抑制萜类和多酮代谢、其他氨基酸代谢、脂质代谢、糖类生物合成代谢和酶家族的代谢（图5）。
图5 PICRUST法预测细菌代谢途径的相对丰度
4 添加不同碳源对菌丝际土壤呼吸的影响
MicroResp技术是用于分析微生物群落对底物的利用能力的一种方法，其原理是向土壤中定量添加不同底物，检测土壤微生物 CO2 产生速率，表征微生物群落对底物利用能力的强弱。在底物为水时，土壤呼吸速率最低。不同碳源作为底物提高了土壤呼吸速率。添加柠檬酸的呼吸速率最高，添加乌头酸的呼吸速率最低。低浓度果糖处理与对照相比差异不显著（P>0.05）。在高浓度果糖处理的土壤中添加葡萄糖和果糖呼吸速率显著增加。而添加海藻糖、柠檬酸和乌头酸与其他处理相比，土壤呼吸速率没有显著变化（图6）。
图6 不同处理土壤MicroResp法呼吸速率
讨论
本研究在玉米菌丝际中加入不同浓度的果糖研究其对有机磷活化的刺激作用。添加较高浓度的果糖通过改变细菌群落结构促进有机磷矿化。这一发现将菌丝际微生物互作介导的碳磷耦合联系在一起。
1 添加高浓度的果糖可提高菌丝际磷酸酶活性
通过添加高浓度的果糖，酸和碱性磷酸酶的活性均显着提高。这表明添加相对较高浓度的果糖（相当于从菌丝分泌的所有C）会刺激AM真菌菌丝际微生物有机磷的矿化作用，而低浓度（相当于菌丝分泌的果糖）则没有作用。在先前的研究中，我们发现在体外培养条件下，果糖可以在转录水平上诱导磷酸化细菌的磷酸酶基因表达。本研究未证实在土壤中的这一观察结果，添加低浓度未显著增加磷酸酶活性。原因可能是磷酸酶从细菌细胞到土壤的释放是复杂的，在转录，翻译和分泌阶段会发生变化。
2 细菌群落结构的改变导致了磷酸酶活性增加
增加的磷酸酶活性可能是由两个可能的机制引起的：细菌数量增加或细菌群落结构的变化。
试验开始时将收集的土壤均匀混合，然后放入盆和菌丝室。从播种后的5周开始，将不同浓度的果糖加入菌丝室。因此，每种处理的起始水平（包括细菌数量和群落结构）应相同。更大的细菌数量意味着更多可能产生磷酸酶的细菌，这是影响磷酸酶活性的重要因素。但是由于以下原因，它不是本研究的决定性因素：首先，与对照相比，添加低浓度的果糖可增加细菌的拷贝数，但不影响酸性或碱性磷酸酶的活性或磷酸酶基因的拷贝数。具体而言，添加果糖增加了糖化细菌的相对丰度，然而糖化细菌不具有ALP基因，但与磷酸酶活性的增加相吻合。其次，在对照和两种果糖处理之间，ALP基因的拷贝数没有显着差异，而加入高浓度的果糖可增加酸性和碱性磷酸酶活性。
细菌的多样性是可能影响磷酸酶活性的另一个重要因素。细菌的多样性受高浓度果糖的显著影响，其第二个机理得到了支持：首先，降低chao 1和Shannon指数，表明通过添加更高浓度的果糖降低了多样性。这与最近的发现一致，即向土壤中添加葡萄糖可以简化微生物群落结构。其次在OTU水平上，与其他两种处理相比，添加高浓度果糖在OTU中的相似性最少。第三，在门的水平上，当添加高浓度果糖时，细菌群落没有与其他处理一起聚集。当添加高浓度的果糖时，Gemmati、monadetes和Chloroflexi的相对丰度显着降低，而Saccharibacteria则显著增加。先前的研究通常向土壤中添加葡萄糖，以研究其对土壤有机质分解的引发作用，重复添加葡萄糖会增加Proteobacteria相对丰度，而降低Acidobacteria和Actinobacteria的比例。这些差异表明，尽管葡萄糖和果糖都属于糖类，但它们的重复添加对细菌群落结构的影响不同。
在基因拷贝数不变的情况下，随着果糖的大量添加和群落的变化，磷酸酶活性的提高只能通过所产生磷酸酶的转录或功效的差异来解释。在缺磷的情况下，所招募的细菌物种转录其碱性磷酸酶基因的效率可能特别高，或者所产生的磷酸酶比其他物种产生的磷酸酶的效率更高。
3 对果糖的偏好改变了细菌群落结构
根分泌物的一些化合物在招募细菌方面发挥着重要作用，例如，水杨酸通过特定的细菌类群调节根微生物的定殖。植物源香豆素形成拟南芥合成根微生物组分。研究发现果糖在转录水平上诱导解磷细菌磷酸酶基因表达的信号，然而，本试验添加低浓度果糖并没有显著改变细菌和潜在产生碱性磷酸酶的细菌的多样性和群落组成，这表明第一种机制没有得到很好的支持。
细菌通常对特定的碳源有不同的偏好，这种选择压力可能导致细菌群落结构的改变。在本研究中，添加高浓度果糖显著改变了细菌和潜在产生ALP的细菌的多样性和群落组成。为了检验这种变化是否是由于细菌对果糖的偏好，我们使用16S rDNA测序数据预测了不同细菌代谢途径的丰度。结果表明，果糖浓度越高，能量代谢、碳水化合物代谢的途径越明显。此外，MicroResp分析证实，添加高浓度的果糖可以提高土壤细菌利用果糖和葡萄糖作为C源的能力，这与糖化细菌的选择一致。上述结果表明，添加高浓度果糖使细菌群落优先使用果糖和葡萄糖，这支持了第二种假设的机制。本试验中只有果糖被用于菌丝际，事实上当添加不同的C源时，土壤微生物呼吸和群落结构发生的变化是不同的，考虑到不同C形态引起的细菌活性和生物多样性的差异，今后的研究应在菌丝分泌物中添加不同的C化合物，比较它们对有机磷矿化的影响。
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