科研 | Water Research：河流微塑料及微生物群落组成：位于荷兰的一项现场研究 / 开普饭

编译：道友留步，编辑：木木夕、江舜尧。

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导读

水环境中出现的新型污染物—塑料，尤其是粒径小于5 mm的微塑料，对生态环境及生物健康构成了潜在威胁。微塑料具有可漂浮、表面疏水等特点，并且是一种新型聚合物碳源，为其表面生物膜的形成构建了独特的环境，可能成为病原体及抗性基因的庇护场所。本研究的目的是调查天然河流（莱茵河）中微塑料浓度、微塑料聚合物类型和微塑料中微生物群落以及相关的毒性基因和抗性基因。在位于荷兰的莱茵河畔设置了两个取样点，分别在2019年夏季（7月）及2020年冬季（1月）进行两次取样分析。通过梯级筛分法（500/100/10μm）筛分收集了微塑料样品；利用红外光谱法对微塑料进行了表征；利用16s rRNA和实时定量荧光PCR（qPCR）对微生物群落、毒性基因及抗性基因进行了分析。结果表明：河水中平均微塑料浓度为213147 个/m³（河水）；聚酰胺和聚氯乙烯是含量最多的聚合物。100-500 μm 样品中的微生物组成与表面水体及10-100 μm 或更小的样品中的微生物组成具有显著区别，主要表现为微生物多样性更低。随着颗粒尺寸变小，观察到更多的“水状”微生物群落。此外，还分析了特定的微生物种类、聚合物类型、颗粒尺寸、季节变化、试验方法之间的相互关系。已知的形成生物膜和降解微塑料的微生物种类在特定的样本中富集，其他的风险标志如抗性基因sul1 和 erm(B)几乎无处不在。微生物组成随季节、聚合物类型和颗粒大小而变化的结果与物种选择机制的存在及微生物多样性的降低现象相吻合。本研究为了解河流环境微塑料污染提供了最新的实地数据及见解。

论文ID

原名：Riverine microplastic and microbial communitycompositions: a field study in the Netherlands

译名：河流微塑料及微生物群落组成：位于荷兰的一项现场研究

期刊：WaterResearch

IF：9.13

发表时间：2021.01

通讯作者：LapoMughini-Gras

通讯作者单位：荷兰比尔索芬国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心；荷兰乌得勒支大学风险评估科学研究所。

实验设计

在位于荷兰的莱茵河畔设置了两个取样点，分别在2019年夏季（7月）及2020年冬季（1月）进行两次取样分析。通过梯级筛分法（500/100/10 μm）筛分收集了微塑料样品，分别用于分析微塑料及微生物组成。此外，还额外收集了筛分前后的水体（地表水和滤液）用于微生物分析。利用红外光谱法对微塑料进行了表征。利用16s rRNA测序对微生物组成进行了分析，过程中分别采用“浮选（flotation）”和“均质化（homogenisation）”两种方法对样品进行过滤处理。利用实时定量荧光PCR（qPCR）对毒性和抗性基因进行了分析，其中选择sul1 和erm(B)作为抗性基因的指示基因，选择stx1 和 stx2作为毒性基因的指示基因。借助广义线性模型（GMLs）、α-diversity多样性、典型关联分析（CCA）、非参数多元方差分析（PERMANOVA）等方法比较分析了各样品微塑料及微生物组成的异同。

图1 取样点分布图（取样点1：Viaten；取样点2：Lobith）

结果

1微塑料

在所有样品中均发现了微塑料的存在。最高及最低的微塑料浓度均出现在Vianen，分别为：夏季334667 个/m³、冬季102708个/m³。整体上，夏季微塑料的浓度要高于冬季（p=0.001），20-100 μm微塑料数量显著高于100-500 μm微塑料（p＜0.001）。估算的10-20 μm微塑料颗粒数夏季约为800000个/m³，冬季约为500000个/m³。在夏季，大于500 μm的颗粒数约为2500个/m³，而冬季约为1500个/m³（表S1），而取样点之间的微塑料浓度未发现显著差异。不同季节和地点之间微塑料平均浓度为213147个/m³。聚酰胺和聚氯乙烯是含量最高的聚合物类型（占总量分别为30%和26%）。除聚苯乙烯和聚氨酯外，其他聚合物颗粒在20-100 μm范围内的数量要显著高于100-500 μm。聚丙烯和聚氯乙烯在夏季的浓度明显高于冬季，而取样点之间的差异不显著（表S2）。当以相对丰度的方式分析各聚合物类型浓度（即每种聚合物类型的浓度占样品中总微塑性浓度的比例（图S2）），可以发现如下的显著区别：①聚丙烯颗粒大多为100-500 μm，而不是20-100 μm（p=0.009）；②聚氯乙烯在夏季的浓度显著高于冬季（p＜0.001）；聚苯乙烯在Lobith的浓度高于Vianen。

表1 两个取样点微塑料平均浓度及聚合物类型

2 微生物群落

从八十个样品产生总计得到了8390415个高质量序列，产生了480个微生物分类群，分布于2界（99.9%细菌，0.1%古菌），29门（主要为：Proteobacteria 47%、Bacteroidetes 17% 以及 Cyanobacteria 14%），67纲（主要为：Betaproteobacteria 21%、Gammaproteobacteria 17% 以及 Chloroplast 11%），102目（主要为：Burkholderiales 17%、Pseudomonadales 10% 以及 Flavobacteriales 8%），171科（主要为：Comamonadaceae 14%、 Moraxellaceae 9% 以及 Sporichthyaceae 5%），307属（主要为：Acinetobacter 7%、Flavobacterium 5%以及hgcI clade 4%）。图2展示了丰度最高的15个物种在属水平的相对丰度。

图2 总体及不同样品、不同季节、不同取样点、不同过滤方法中丰度最高微生物物种的相对丰度（属水平）

3 Shannon指数

500 μm样品中微生物群落Shannon指数最低，而10 μm样品中微生物群落Shannon指数最高。500 μm样品中微生物群落的α-多样性显著低于其他样品（p＜0.001），其余样品之间的α-多样性没有显著差异。冬天各样品的α-多样性显著增加（p＜0.001），并且使用“均质化”方法过滤样品时所得微生物群落的α-多样性也高于“浮选”法。两个取样点之间微生物群落的α-多样性没有显著差异。α-多样性与微塑料浓度或特定聚合物类型没有显著相关关系。

图3 不同样品、不同季节、不同取样点、不同过滤方法微生物群落的α-多样性（Shannon指数）

4 微生物群落特征

PERMANOVA 和CCA分析（图4）表明不同样品之间（不相似性：77.56%；p＜0.001）、不同季节（不相似性：71.92%；p＜0.001）、不同过滤方法（均质化法和浮选法）（不相似性：67.10%；p=0.004）微生物群落存在显著的差异（不相似性：77.56%；p＜0.001），但是取样点之间无显著差异。PERMANOVA的事后检验表明，各样品显著差异主要在于：地表水和500 μm样品之间（84.20%不相似性），地表水和100 μm样品之间（74.61%不相似性），滤液和500 μm样品之间（82.55%不相似性），滤液和100 μm样品之间（74.61%不相似性），10 μm样品和500 μm样品之间（81.34%不相似性），10 μm样品和100 μm样品之间（69.76%不相似性）。因此，500 μm和100 μm样品的微生物群落组成相似，而10 μm样品、筛分前后水体中的微生物群落组成相似。随着颗粒变小，微生物群落似乎也向更像“水状”（water-like）转变。因此，在后续分析中，将样品类型分为小颗粒/类水样品(即筛分前后水体和10 μm样品)和大颗粒样品(即500 μm和10 μm样品)。

在观察到的480个类群中，只有21个类群的微生物群落组成差异大于50%（表2），其中大多数类群在特定的样品组中显著富集（图5和S6）。最显著的差异在于不同样品和不同季节之间Acinetobacter相对丰度的差异，以及不同过滤方法之间Flavobacterium相对丰度的差异（图6）。表S3给出了相对丰度的差异。

表2总体及不同样品、不同季节、不同取样点、不同过滤方法中丰度最高微生物物种的相对丰度（属水平）

图4 不同样品（500 μm，100 μm，10 μm，地表水，滤液）、不同季节（夏季，冬季）、不同地点及不同过滤方法（均质化，浮选法）之间微生物群落的典型相关分析。图中共计80个样品点，以颜色加以区分。（蓝色=地表水；红色=500 μm样品；橘色=100 μm样品；棕色=10 μm样品；绿色=滤液）。四边形表示夏季从Lobith（正方形）、Vianen（菱形）收集的样品；三边形表示冬季从Lobith（三角形）、Vianen（倒三角）收集的样品；空心的符号表示用浮选法所得的样品，实心的符号表示用均质化法所得的样品。

图5在属水平上的总体微生物群落组成的典型相关分析图，表明主要导致在样品类型、季节和过滤方法之间观察到的差异的分类群。数据点代表典型对应分析中包含的特征的位置，即表2中展现的差异最丰富的分类群（点），以及定义样本组的变量（三角形），即样本类型、季节和过滤方法。采样位置之间的差异不明显，因此无法可视化。“小颗粒/类水”样品包括地表水、滤液和10 μm微塑料样品，而“大颗粒”样品包括500 μm和100 μm微塑料样品。“方法1”对应于浮选方法和“方法2”对应于均质化方法。

图6样品类型、季节和过滤方法之间不同丰度的分类群。A组：点表示“小颗粒/类水”样品（即地表水、滤液、10 μm微塑性样品）和“大颗粒”样品（即500μm和100μm微塑性样品）之间丰度存在统计显著差异的分类群。Y轴上的负值表明，“小颗粒/类水”样品中的分类群少于“大颗粒”样品中的分类群，反之亦然。B组：点表示夏季和冬季样品在丰度上具有统计显著差异的分类群。Y轴上的负值表明，夏季类群的丰度低于冬季，反之亦然。C组：点表示两种过滤方法在丰度上存在统计显著差异的分类群。Y轴上只有正值，因为所有显著差异都与浮选法分析的样品中比均化法更丰富的分类群有关。只考虑了表2中所报告的引起整体群落结构差异性的分类群。

5 微塑料和微生物

在32个10 μm和100 μm成对样品的子集中，研究了不同丰度分类群和聚合物类型相对丰度之间的关联，分析了微生物群落组成，并分别与20-100和100-500 μm的分析塑料粒径相耦合（图7）。聚对苯二甲酸乙二酯与Chloroplast（p=0.012）呈负相关，与Flavobacterium（p=0.021）和Simplicispira（p=0.009）呈正相关；聚丙烯与Acinetobacter呈正相关（p＜0.001），还包括聚苯乙烯与Hydrogenophaga（p＜0.001），聚乙烯与Pseudomonas（p=0.036），异戊烯与Pseudarcicella（p＜0.0001），聚氨酯与Synechococcus（p＜0.001）。聚氯乙烯颗粒与Flavobacterium（p=0.011）和Synechococcus（p=0.007）。未知其聚合物成分的微塑料颗粒与Massilia呈正相关（p=0.035），与Hydrogenophaga ( p=0.007)和 Acinetobacter ( p< 0.001)呈负相关。

图7丰度存在差异的分类群的典型对应分析图以及微塑性聚合物类型的群变量和相对丰度。数据点表示CCA中包含的特征的位置，即表2和图6中报告的丰度差异最大的分类群（蓝色），组变量（绿色）样品类型，季节，过滤方法和取样位置，以及每种聚合物类型的相对丰度（红色）。“小颗粒/类水”样品包括地表水、滤液和10 μm微塑料样品，而“大颗粒”样品包括500 μm和100 μm微塑料样品。位置1对应“Lobith”，位置2对应“Vianen”（图1）。过滤方法1对应于浮选方法，过滤方法2对应于均质化方法。PA=聚酰胺，PE=聚乙烯（PE），PET=聚对苯二甲酸乙二酯，PP=聚丙烯，PS=聚苯乙烯，PU=聚氨酯，PVC=聚氯乙烯。分析基于32个10 μm和100 μm的微塑料样品的子集，这些样品的微生物群落组成可分别与20-100 μm和100-500 μm的分析粒径进行有意义的耦合（表1）。分析基于所有分类群（480），但只报道那些差异丰富（表2和图6），以提高可视化性。

6 致病菌

针对样本中检测到的和已知含有治病物种的菌属，如Acinetobacter ,Pseudomonas , Legionella , Mycobacterium 和 Arcobacter，我们发现大颗粒中含有的Acinetobacter（相对丰度14.6%）和Pseudomonas（相对丰度2%）显著高于细颗粒/水状样品（0.7%和0.8%）。然而Legionella和 Mycobacterium与样品类型无明显的相关性。对于Arcobacter，所有样品中的丰度都显著高于500 μm样品中丰度（p＜0.001）。

7 毒性和抗性基因

毒性基因stx1和 stx2在所有样品中都未检测到，但是抗性基因erm(B)和 sul1分别存在于80个样品中的75和79个样品中，致使所有样品中erm(B)的存在率为93.8%，sul1的存在率为98.8%。5个缺乏erm(B)和1个缺乏sul1的样品均是在夏季于Viaene的500 μm的样品。

讨论

本研究发现，大颗粒微塑料（100-500 μm）上形成的微生物膜的微生物多样性要低于地表水和小颗粒微塑料（10-100 μm或更小）上的生物膜。这可能与小颗粒比大颗粒具有相对更大的附着面积有关。此外，随着粒径减小，生物膜有向水状转变的趋势，这表明浮游微生物在筛网的最底层（10 μm）上积累。我们也观察到，相比空间异质性，时间异质性体现的更为显著，季节变化在显著影响微生物群落。

淡水系统中微塑料中分类群的多样性通常低于水体本身或是天然基质表面。我们还发现，聚丙烯大颗粒含量丰度更高（微生物多样性最低），曾有报道也表明聚丙烯上微生物的多样性较低。此外，夏季微生物多样性低于冬季，尽管夏季微塑料浓度高于冬季。夏季的微生物多样性较低曾在不同的淡水环境中观测到，似乎是由除了温度及其他多个理化因素驱动的。

以前的研究已经展示了塑料和水体中微生物群落的差异性。这些差异是很有趣的，因为河流中微生物之间近在咫尺，并且样品是同时收集的。其中最有趣的差异在于Gammaproteobacteria（特别是Acinetobacter ,Pseudomonas , Thio-

thrix ， Alkanindiges）的差异和Betaproteobacteria（特别是大颗粒上的Roseateles，Massilia ，Hydrogenophaga，Acidovorax）以及不同的Bacteroidetes和 Actinobacteria （特别是小颗粒/水状样品上的 NS11-12，hgcI clade，Pseudarcicella，Candidatus Planktophila）（图6）。以前的研究也报道了类似的发现，尤其是Gammaproteobacteria和 Betaproteobacteria在塑料上更丰富，Bacteroidetes和Actinobacteria在天然基质上更丰富。Gammaproteobacteria的某些菌种是人工基质上早期生物膜的产生者，而Pseudomonas以在塑料上繁衍著名。暴露于致病性Pseudomonas可能引起表皮磨损和耳朵感染，并且据报道两种人类条件致病菌（Pseudomonasmonteilii和Pseudomonas mendocina）和一种植物病原菌（Pseudomonassyringae）只存在于微塑料上。我们发现Pseudomonas在高聚乙烯浓度的样品中更为丰富，而Pseudomonas能够生物降解塑料聚合物，尤其是聚乙烯。值得强调的是，对塑料聚合物成分和微生物群落组成之间可能存在的联系进行了分析。虽然这种相关研究设计使我们能够确定微生物群落组成是否因不同塑料聚合物的丰度而异，但是并未能够提供它与分析特定聚合物类型的单个塑料片上微生物组合相同的详细程度。虽然这项研究的主要目的是提出假设而不是检验它们，但是前面提到的关于微生物多样性以及塑料聚合物和微生物类群之间的不同关联的大多数结果都是先前观察到的，这意味着我们的结果在本质上是证实性的，这反过来又支持了一般分析的有效性。因此，我们的研究结果支持这样一个普遍观点，即微塑料可以作为微生物定植的独特基质，并且在微塑料生物膜发育过程中发生分类单元选择，导致支持多样性的能力降低。

微塑料通常被认为是病原微生物的潜在载体。除了生物膜相关的和可能的塑料降解微生物类群外，还发现了已知含有潜在致病性物种的类群，如Pseudomonas，Acinetobacter 和 Arcobacter，以及选定的抗性基因。虽然stx1和stx2基因的缺失可能是由于缺乏可检测到的Escherichia和 Shigella（尽管这些基因在其他Enterobacteriaceae也有描述），可以假设，在水生环境中发生的选择起到了一定的作用，因为这些基因不会促进细菌在这种环境种生存。相反，抗性基因将赋予细菌生存优势，因为表面水体，尤其是废水中存在抗菌残留物。此外，微塑料污染环境中多种抗性的共同选择是一个新出现的风险，微塑料已成为产生和传播的热点。一些研究报道了致病菌在微塑料上的选择性富集。Acinetobacter和Pseudomonas，及其包含的几个治病菌种，在大颗粒物中的含量明显高于地表水或小颗粒/类水样品。此外，Arcobacter（也包括潜在的病原菌）在颗粒物上的含量几乎与在水中的含量相同，但在100和10 μm样品中含量更高。由于我们的分析没有考虑到物种鉴定，而只考虑到可能含有已知致病物种的属，因此需要进一步的研究来证实这些发现。16S rRNA基因测序是用来确定微生物群落结构的有效工具，但是宏基因组测序能够提供更为详细的信息，包括微生物种类、毒性基因和抗性基因，因此它对确定不同环境的基因组潜力特别有用。

本研究存在着一些不足。我们无法完全从悬浮物颗粒中区分出微塑料颗粒。除非手动取出（相对较大）塑料颗粒或使用控制性风化试验（其中已知聚合物和浓度的特定塑料颗粒暴露在给定的水环境中），否则很难以不影响或损伤生物膜的方式从地表水中分离、表征微塑料颗粒。虽然我们的方法不够完善，但实现了直接分析样品，并且能够同时进行化学和微生物学分析。此外，尽管样品并非由100%的塑料组成，但微生物群落结果与对照实验中仅使用塑料颗粒的研究结果具有高度可比性。这表明，取样确实捕获了塑料颗粒，而非塑料颗粒对样品的影响是有限的，即使试验结果不完全是塑料导致，也与塑料的驱动有关。不同过滤方法产生的微生物群落也存在差异。在浮选法中，捕获的塑料颗粒部分包括漂浮的塑料颗粒，因此结果主要代表与（增强的）微塑料浮力和低密度颗粒相关的微生物群。相反，均质化方法获得的样品包括沉淀物，其中塑料的密度超过水的密度，但也包括非塑料残留物（泥沙或其他）。因此，两种过滤方法在为样本中的整个微生物群落提供数据方面相互补充。

结论

微塑料广泛存在于所分析的样品中，其浓度、聚合物类型和微生物群落主要因季节和粒径而异，而不同取样点之间差异较小。结果与分类单元选择机制的存在和塑料基质生物膜中微生物多样性的降低相一致。一些生物膜相关和塑料降解类群在某些类型的样本中富集，并且与特点的塑料聚合物结合更为紧密，包括可能窝藏人类（肠道）致病菌的类群以及普遍存在的抗性基因。这些信息有助于了解河流环境中的微塑料污染，引起对于公众和生态系统健康安全的认识，包括微塑料通过淡水扩散的危害，以及微生物引入微塑料导致水传播疾病和抗性基因的全球传播的危害。

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科研 | Water Research：河流微塑料及微生物群落组成：位于荷兰的一项现场研究

IF：9.13

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