股骨头坏死动物模型的特点
本文原文刊发于《中国组织工程研究》，特向原作者致谢！
中图分类号：R447；R965.1；R68
2 结果 Results
2.1 四足动物股骨头坏死动物模型
2.1.1 物理法(高温和冷冻)
诱导的动物模型目前物理性股骨头坏死动物模型的建模方法主要有低温冷冻和高温加热，通过这2种方法均能诱导出成功率高、重复性好、可控性高的早期股骨头坏死模型，而且造模时间较快，均能够较好模拟人早期股骨头缺血性坏死，但这2种方法主要通过外部施加的物理因素造成股骨头缺血性坏死，故造出的模型并未能完全体现人股骨头坏死的自然病理演变过程，对临床上由于激素、酒精等其他原因引起的股骨头坏死研究有所局限，见图2。
低温冷冻诱导的动物模型：低温冷冻股骨头坏死主要采取如液氮、氩氦刀靶向冷冻系统等冷媒物理破坏股骨头血供来造成股骨头缺血性坏死，具有造模时间较快、动物存活率高的优点，但缺点是难以造成股骨头塌陷。2006年顾晓峰等[2]通过外科手术使犬股骨头脱出，并用液氮棉球湿敷股骨头3 min以破坏股骨头的血供，3周后X射线可见股骨头坏死，11周时出现股骨头塌陷。2009年刘国柱等[3]往外科脱位的犬股骨头套入橡胶管并灌注液氮1 min，自然复温，16周后X射线可见股骨头坏死表现，患髋哈弗氏系统重建，其模拟了临床上股骨头坏死的坏死修复过程。2011年Vélez等[4]改良了低温冷冻方法，采用冷冻探针和血管结扎的方法，造成了羊股骨头坏死，第6周的组织学表现为早期坏死性改变，12周时有典型的晚期骨坏死表现。2012年Vélez等[5]用低温冷冻诱导15只成年绵羊右髋早期骨坏死，骨坏死诱导后6周，MRI表现为典型的早期股骨头坏死改变，无股骨头塌陷或关节间隙缩小。2014年阮康明[6]通过比较激素法和液氮冷冻法建成的犬早期股骨头坏死模型，发现液氮冷冻法造模成功率和重复率高，可控性好，而激素法则相反，但激素法更适合模拟人股骨头坏死的演化过程，对股骨头坏死的病因病理研究更适合。2014年巩建宝[7]利用氩氦刀靶向冷冻系统在MRI定位下对Beagle犬进行2个冷冻-复温循环处理，可有效制备的早期股骨头坏死模型。2014年谭振等[8]通过钻头往山羊股骨头钻孔制备一个液氮冷冻空间，并注入液氮由内向外进行冷冻损伤成功建立山羊股骨头坏死模型，术后组织病理学发现实验组空骨陷窝率>50%，该方法诱导出的坏死成功率达到91.67%。2014年Poignard等[9]利用猪为实验对象，联合低温损伤与旋后血管的血管凝血成功诱导出了猪的股骨头坏死模型，3周后MRI和组织学检查发现骨软骨坏死，14周后出现股骨头塌陷，该方法诱发的猪模型能模拟体现人类股骨头坏死的各个阶段，值得进一步发展完善。2016年李玉龙[10]通过改良造模手术方式，避免了常规切开关节囊和脱位股骨头的方法，利用液氮冷冻法也成功制备了兔股骨头坏死动物模型，该改良方法手术创伤小，操作相对简单，而且较大程度保持了髋关节的完整性,操作简单，提高了造模成功率。
高温加热诱导的动物模型：除了低温冷冻，高温加热也是建立物理性股骨头坏死动物模型的方法，该方法主要通过高温加热造成骨组织细胞的损伤以达到股骨头缺血坏死的效果，具有可控性高、创伤性低、重复性高的特点。2009年Li等[11]通过微波加热诱导了兔股骨头坏死坏死模型，4-6周时股骨头密度降低，6-10周时大部分出现囊性改变，10-12周时有69%股骨头塌陷。2013年Long等[12]应用体外高强度聚焦超声建立犬股骨骨坏死模型，在250 W的强度下发现股骨头和股骨颈上有明显的变形，组织学上提示髓腔内细胞减少，此方法提示高强度聚焦超声是一种较好的无创性造模方法，但还需进一步探索完善。2016年徐燕等[13]同样利用高强度聚焦超声制备了兔股骨头坏死模型，具体方法为利用聚焦超声治疗系统(强度为80 W/cm2)照射家兔双侧股骨头，照射后1-21 d可见不同程度的股骨头坏死表现，提示此方法制备的模型效果稳定，能一定程度体现病理演变特征。
物理性股骨头坏死动物模型的建模方法虽然具有一定优势，但与临床股骨头坏死的病因差异较大，因此注定这种模型不适宜于股骨头坏死病因和发病机制的研究。至于是否能够再现股骨头坏死后早期到晚期的病理特征和病理演变过程，特别是股骨头负重区塌陷的发生和发展的过程，则有待于进一步的观察和研究。在此基础上是否能够适用于手术治疗方式的评价，则取决于动物平台能否体现人类双足站立的生物力学特点和能否有足够大的体量进行临床手术操作模拟。
2.1.2 酒精诱导的动物模型
针对酒精性股骨头坏死病因研究，有学者认为骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化能力发生改变是酒精性股骨头坏死的主要诱因之一[14]。目前主要通过酒精灌胃和股骨头局部注射乙醇的方法来诱导酒精性股骨头坏死模型，但造出来的模型成功率不高，往往不能进展到后期股骨头塌陷，且一旦把握不好酒精剂量和造模时间的话容易导致实验动物死亡。虽然酒精法能够很好模拟人类嗜酒过程，并在组织学提示早期坏死表现，但仍需在模拟股骨头后期塌陷和控制动物死亡率上进一步改良，建立一个可靠的模型才能更好地推进酒精性股骨头坏死的病因病理研究。2001年Simank等[15]在X射线透视下直接注射乙醇于股骨头中心，出现了组织学上可证实的股骨头中央部坏死。2002年Manggold等[16]向股骨头中心注射纯乙醇建立了美利奴羊股骨头坏死模型，术后12周出现股骨头坏死，在组织病理学检查和X射线下可看到股骨头区域的明显病理变化。2005年齐振熙等[17]对SD成年大鼠进行酒精灌胃以模拟人股骨头坏死成因，20周后可见股骨头大片骨坏死，同时表明乙醇剂量是决定股骨头坏死程度的正相关因素。2008年李鸿帅等[18]通过用克氏针固定Beagle犬的一侧前肢体，在犬的三足负重模式下往股骨头局部注射酒精造成股骨头坏死模型，研究发现股骨头坏死后犬三足负重产生的持续的生物应力是阻碍修复反应从而导致股骨头塌陷的重要因素。2011年Zhu等[19]向往羊的股骨头中心注射无水乙醇，X射线显示12周时股骨头的轮廓轻微变形，25周时出现轮廓变形伴关节间隙变窄。在组织学上发现了与人类股骨头坏死自然历史高度一致的现象，主要表现为骨小梁、骨髓坏死、重建不足和微循环破坏，见图2。
2.1.3 激素诱导的动物模型
激素法在模拟人激素性股骨头坏死病因病理方面应用比较广泛，但建模过程中所使用的激素种类、剂量、建模方式上存在一定的差异，尚无统一的标准，而且建立的模型还存在造模时间长，成功率低，动物死亡率高、股骨头塌陷率低等问题，故还需进一步发展完善，见图2。
单纯激素诱导的动物模型：2005年Miyanishi等[20]通分别对实验兔右臀中肌注射25 mg/kg泼尼松龙琥珀酸钠、20 mg/kg甲泼尼龙醋酸盐以及20 mg/kg曲安舒松，结果显示其中甲泼尼龙醋酸盐诱导股骨头缺血性坏死成功率更高。2010年肖春生等[21]比较不同种类、不同剂量激素的股骨头坏死动物模型发现，甲泼尼龙醋酸盐是目前诱导激素性股骨头动物模型较好的选择。2011年Kerachian等[22]通过外科手术在大鼠颈部外侧皮肤下植入强的松缓释微丸，平均剂量释放为1.82-2.56 mg/(kg·d)，持续90 d，其模拟了人早期激素性股骨头坏死的动物模型。
激素联合脂多糖诱导的动物模型：为了提高造模成功率及缩短造模时间，有学者利用脂多糖能对血管壁造成损伤从而使血液高凝的特点，通过脂多糖联合激素来诱导高凝血状态下激素性股骨头坏死病理生理过程，成功建立激素性股骨头坏死动物模型。2010年Guan等[23]以兔为实验对象，通过醋酸泼尼松龙联合脂多糖进行肌注，与单纯肌注醋酸泼尼松龙对比发现，联合脂多糖能提高建模成功率，同时提示在激素性股骨头坏死的情况下，异常的高凝状态可能会增强血栓形成，从而影响股骨头缺血坏死这一病理过程。2014年Ryoo等[24]同样利用激素联合脂多糖成功诱导出小鼠股骨头坏死模型，并发现联合脂多糖可明显提高激素诱导股骨头坏死的发生率。2016年黄思俊等[25]经新西兰兔耳缘静脉注射1次低剂量的脂多糖后，然后每隔24 h对兔肌肉分别注射3次高剂量的甲基强的松龙，诱导建立兔股骨头缺血坏死模型成功率高，且死亡率低，是目前较好的一种非创伤性模型。2016年张琳等[26]利用不同剂量大肠杆菌脂多糖联合甲基强的松龙造模，发现脂多糖剂量为40 μg/kg时造模效果最佳。2016年董维等[27]采用甲强龙联合脂多糖也成功诱导出了兔激素性股骨头坏死模型，但未发现股骨头塌陷。2017年王继涛等[28]在利用激素联合脂多糖建模的过程中，通过调整饲料槽的高度，迫使小鼠主动站立取食，并予跑步机上跑步2 h/d来改良了传统造模方法，也提高了造模的成功率。
激素联合异体血清诱导的动物模型：除采取激素联合脂多糖诱导建模外，也有学者采用马血清注射致过敏性血管炎并随后给予大剂量皮质类激素来诱导股骨头坏死动物模型。2008年Wen等[29]以健康新西兰兔为实验对象，先经耳静脉注射马血清(10 mL/kg)，然后小剂量(7.5 mg/kg)多次腹腔注射醋酸泼尼松龙，5周末时出现激素性股骨头坏死迹象，但是该方法诱导的兔股骨头坏死模型仅停留于激素性股骨头坏死的早期，不能发展到股骨头坏死的塌陷后期，但联合注射血清和皮质类固醇激素可以提高股骨头坏死的成功率，并且建成的模型与激素所致股骨头坏死的临床疾病进展有一定程度的一致性，对开发新的治疗药物和早期诊断和治疗具有一定意义。
2.1.4 创伤性股骨头坏死动物模型
股骨头血供受损是创伤性股骨头坏死的主要发病原因[30]，因此通过外科手术破坏股骨头血供建立股骨头坏死动物模型来模拟临床上股骨颈骨折、髋关节脱位等原因导致的创伤性股骨头坏死有重要意义。但该建模方法也存在一定的弊端，比如手术过程复杂，对实验动物组织损伤大，容易导致实验动物死亡，虽然能在病因上模拟股骨头缺血坏死，但在病理演变上与人股骨头坏死病理改变还有存在较大差别，见图2。
手术诱导的动物模型：1993年Swiontkowski等[31]发现应用外科手术造成小型猪股骨颈骨折导致股骨头坏死的严重程度和发病率与人类相当，提示小型猪是进一步研究人类股骨颈骨折并发症股骨头坏死的有用模型。2009年Hofstaetter等[32]通过完全摘除兔髋关节囊，烧灼股骨颈周围骨膜及血管，以切断股骨头髓外的血供，然后用不可吸收线缝扎圆韧带，并通过一个3 mm钻孔经股骨颈进入骨髓腔，烧灼髓内血管以切断髓内血供。此方法通过破坏髓内和髓外血供的方法建立了兔股骨头坏死模型，但术后股骨头塌陷率较低，15只实验兔中只有2只出现了塌陷。2009年Peled等[33]通过切开大鼠髋关节囊，使股骨头脱位，同时剪断圆韧带，破坏骨膜来诱导大鼠股骨头坏死动物模型，虽然术后有看到股骨头变形，但是未见明显的组织学坏死表现。2011年Hwang等[34]利用新西兰大白兔作为实验动物，经手术诱导股骨头坏死，具体手术方式为，先对股骨大转子截骨，关节囊切开后，切取圆韧带，令股骨头半脱位，然后用直径为0.4 mm的钢丝捆绑股骨颈，利用电灼法烧伤股骨颈，待股骨头复位后，用髓内针固定股骨头大转子。术后2周组织学提示股骨头缺血坏死，研究提示电灼法能有效提高诱导股骨头坏死的成功率。通常用于研究股骨头坏死的大鼠模型涉及到利用髋关节外侧入路手术诱导股骨头坏死。然而，这种方法手术过程导致髋关节脱位，这意味着很难确定骨坏死是由于血管剥夺还是由于髋关节脱位引起。2011年Kim等[35]同时采取外侧入路和内侧入路手术方式建立动物模型，术后组织病理学检查发现这2种方式均能成功诱导股骨头坏死，但内侧入路不引起髋关节脱位，更好地保护了髋关节的组织结构，故更适合用于手术诱导股骨头坏死动物模型。2012年Gao等[36]利用狗做实验动物，通过切开狗髋关节囊，阻断股骨头骨外血供，采用低速钻造成股骨基底部骨折，致股骨颈缺血性坏死，成功诱导出了股骨头缺血性坏死动物模型。2012年Wen等[37]通过手术造成股骨头基底部骨折从而阻断股骨头血供的方法建立了成年兔的股骨头坏死模型，术后CT、MRI和组织病理学检查提示出现ARCO( 国际骨坏死和骨循环协会， AssociationResearch Circulation Osseous) Ⅰ或Ⅱ期临床股骨头坏死 的改变。2012年Hang等[38]利用类似的手术同样成功诱导出了狗股骨头坏死动物模型，12周后可观察到股骨头坏死的表现。
介入法诱导的动物模型：常规外科手术建立的股骨头坏死动物模型往往避免不了创伤性大、造模时间长等问题，血管介入栓塞法作为新兴的造模方法为股骨头坏死动物模型带来了新思路。2009年马坤等[39]应过Seldinger法对成年犬股动脉进行穿刺插管，明确股骨头供血动脉后，往血管内灌注平阳霉索及填塞可吸收性明胶海绵栓塞，造成股骨头缺血坏死；介入后血管造影显示栓塞侧股骨头供血动脉不显影，第2-6周复查未见再通现象；术后2周病理学检查显示骨髓中造血干细胞坏死，第4周出现不同程度的骨小梁坏死、中断；MRI提示栓塞侧股骨头出现坏死信号。新兴介入法造模虽然目前研究较少，但其造模方法简单明确，对实验动物创伤小，动物死亡率低，造模成功率高，有望较好地模拟人类股骨头坏死的病理生理过程，制作出良好的动物模型，因而该造模方法值得深入研究，或许是破解目前动物造模困境的一个突破点，但具体造模方法还需要大量的实验来完善，如何解决大型动物平台，如何将四足动物的承重模式转化为二足承重，如何标准化建模方式，如何客观化模型评价是有待解决的具体难点。
2.2 二足动物股骨头坏死动物模型的研究进展
目前公认生物力学因素与股骨头坏死后的病理演变存在直接关系，因此在动物造模过程当中必须考虑这方面的影响。由于人为双足行走哺乳动物，因此双足动物在作为人股骨头坏死的动物模型上有着同样双足行走的优势，其双下肢的负重与人类双下肢的生物应力也存在共同之处，这一特点很好地保证了双下肢生物应力在股骨头坏死中的影响作用。通过查阅国内外使用双足动物建立股骨头坏死的文献记载，发现常用于做股骨头坏死的双足动物模型主要包括鸡、鸵鸟与鸸鹋，见图2。
2.2.1 鸡模型
2009年程田等[40]以三黄鸡为对象，通过连续3d胸肌注射地塞米松20 mg/kg，从而建立出股骨头坏死模型，并认为短期应用大剂量激素可造成鸡股骨头坏死。同样使用激素诱导股骨头坏死，肖春生等[21]通过对比甲泼尼龙琥珀酸钠、地塞米松两者剂量及激素种类对股骨头坏死发生发展的影响，得出甲泼尼龙琥珀酸钠相比地塞米松能更好地诱导股骨头坏死的发生。与上述研究不同，2009年王义生等[41]通过马血清致敏联合酒精灌胃，成功制作出鸡酒精性股骨头坏死的模型，且在节省了在造模时间及经济上的花费的同时也提高了成功率。2010年李广贤[42]则采用外科手术方法，通过切断股骨头周围动脉血管，从而使鸡股骨头缺血性坏死。
2.2.2 鸵鸟模型
鸵鸟因为具有与人类相似组织属性的股骨头而同样被用于建立股骨头坏死模型。2013年王鹏飞[43]取健康鸵鸟行股骨头影像学、组织学和生物力学检查，发现其组织属性接近人类股骨头，具备股骨头坏死动物模型的条件，随后其应用液氮循环冷冻法建立股骨头坏死模型，发现鸵鸟股骨头出现塌陷，且该病理过程与人类相似[44]。鸵鸟由于髋关节组织结构属性虽然与人类相似，且鸵鸟体型大，制作出来的坏死股骨头标本病变特征明显而且容易观察，故在模拟股骨头坏死塌陷机制上有一定的优势，但目前发现用于股骨头坏死模型的研究却比较少，这可能与鸵鸟作为珍稀动物，来源困难有关，同时鸵鸟作为非哺乳动物，在探讨人类酒精性和激素性股骨头坏死病因研究方面还存在一定的局限性。
2.2.3 鸸鹋模型
同样作为大型二足负重动物，鸸鹋体型仅次于鸵鸟，加之其生性好动，股骨头承受的压力较大，因此用于股骨头坏死模型的制作亦十分适合。2002年Conzemius等[45]采用液氮喷射的方式造模，成功造出鸸鹋的股骨头坏死模型，但由于采用液氮直接喷射不能使得股骨头坏死区域集中，且损伤的组织范围较大，2011年范猛等[46]发明了一种局部冷热交替装置来建立鸸鹋股骨头坏死模型，克服了组织损伤范围大，液氮直接喷射股骨头坏死区域差异大等问题，且通过冷热交替处理，16周后20只鸸鹋全部出现跛行。同样采用冷热交替的方法造模，2016年曲春涛[47]则在采用液氮冷冻和射频加热交替的基础上加用了导航和定位装置对鸸鹋的股骨头进行钻孔处理，术后检查发现部分鸸鹋出现股骨头塌陷表现，并且出现髋关节轻度脱位的晚期表现，诱导出的鸸鹋股骨头坏死模型与人股骨头塌陷病理过程相似。在鸸鹋的酒精性股骨头坏死造模方面，2014年范猛等[48]在鸸鹋股骨头负重区插入特制的治疗探针，然后利用探针往股骨头局部缓慢注射无水乙醇来诱导鸸鹋股骨头坏死模型，结果显示股骨头出现部分坏死，同时观察到活跃的骨坏死修复反应。该方法虽可成功在短时间内造出酒精性股骨头坏死动物模型，但其发病原因与人酒精性股骨头坏死发病原因和发病机制不同。鸸鹋与鸵鸟一样，具有与人类相似的股骨头组织属性，生性较鸵鸟更为好动，股骨头负重更为明显，体型虽较鸵鸟小，但仍属大型二足行走动物，在股骨头组织学、生物力学、股骨头的病理学改变等的观察研究上具有优势，但其亦存在着同鸵鸟动物模型一样的缺陷，且鸸鹋为澳洲稀有的动物，数量较少，分布范围较小，饲养难度亦大，获取的途径较局限且难度大，因此两者不利于重复实验，难以推广。
3 总结与展望 Conclusions and prospects
由上可知，股骨头坏死动物模型造模方法多样，各有优缺点。虽然四足哺乳动物与人类有较好的亲缘性，在探讨股骨头坏死的发病机制方面较二足动物有优势，但造出来的模型大多局限于模拟早期的股骨头缺血坏死过程，未能进展到后期塌陷。因为实验侧患肢会保护性限制负重，未能使坏死侧肢体产生正常的生理应力，故较难模拟股骨头坏死后期的塌陷过程，所以四足动物模型造模方法还需往创造实验动物双足负重方向作进一步研究改进。二足动物的双下肢负重特性与人类双下肢的生物应力存在共同之处，虽然能较好模拟后期股骨头塌陷的过程，但所采用的二足实验动物均为非哺乳动物，与人类亲缘性较差，故在探究人股骨头缺血坏死的发病机制和防治方面较哺乳动物效果差，但也在如何更好模拟人股骨头塌陷方面给四足动物模型改进带来新思路，比如怎样选择建模动物和设计建模方法去创造一个符合人双下肢生理力学的动物模型。另外，物理法造模时间短，成功率高，可重复性强，但该种方法造模与临床股骨头坏死的病因差别较大，并未能完全体现人股骨头坏死的自然病理演变过程，对临床上由于激素、酒精等其他原因引起的股骨头坏死研究有所局限。激素法和酒精法在探讨激素性和酒精性股骨头坏死病因病理方面有较大帮助，但其造模方式还需克服自身弊端，比如造模时间长，动物死亡率高等问题。创伤法能较好模拟人创伤性股骨头坏死的病因病机，但对髋关节组织损伤较大，造模过程复杂，动物存活状态差，还需进一步改进完善。新兴介入法造模通过介入法对股骨头主要供血动脉进行栓塞，创伤性小，造模时间短，成功率高，而且明显降低了实验动物的死亡率，是目前值得进一步探索完善的造模新方法。无论哪种造模方法，应均衡利弊，取长补短，致力建立一个能高度模拟人类股骨头坏死整个病理过程的理想动物模型，以促进股骨头坏死的预防和治疗的进展。
目前，建立理想股骨头坏死动物模型的目的主要探索股骨头坏死的发病机制和有效治疗方式，这也是骨科研究的热点问题之一。临床上治疗股骨头坏死的多致力于早期干预以防止末期塌陷，正常股骨头坏死区在修复过程中，因为新生的骨小梁为较软的编织骨，在没有限制性负重的情况下，新生骨小梁容易在应力刺激作用下发生骨坏死，从而改变坏死区的力学性能，影响了坏死组织的修复过程，造成继发性塌陷[49]。因此，除了修复股骨头血运，重建坏死股骨头的生物力学稳定对防治股骨头塌陷起着至关重要的作用。目前临床有多种方法用于防治股骨头塌陷，大体上分为重建、维持坏死股骨头的生物力学稳定和促进坏死区的生物学修复两个方面，目的都是为了重建股骨头血运和生物力学稳定，为坏死的股骨头创造一个良好的修复环境。前者主要包括限制负重、旋转截骨、打压植骨、支撑植骨等减轻坏死修复区的力学负荷、增强坏死区的生物力学强度的手段，后者主要包括髓心减压、病灶清除、复合骨移植、血管移植等手段， 但是目前这些治疗方法的效果仍不够满意，一旦股骨头负重区出现塌陷，患者晚期往往需要进行全髋置换手术。由于股骨头坏死的低龄化和人工髋关节使用年限的限制，目前仍需要切实有效的治疗方法来防治坏死股骨头的塌陷。因此，建立一个合适的股骨头坏死动物模型来评价和改良该类手术方式，才能促进临床上纠塌防塌手术的进展。针对目前所面临的临床困境，同时结合目前造模方法的研究进展，作者认为今后的造模工作应该重视实验动物的体量选择、微创精准造模和生物力学因素对坏死股骨头塌陷的影响这3个方面内容，同时尝试转变四足哺乳实验动物负重模式(模拟人类二足负重)，选择体量适中可以模拟临床手术的动物进行造模是值得尝试的研究方向。
综上所述，理想的股骨头坏死动物模型应具备以下几点要求：①造模时应重点对实验动物的股骨头负重区造成骨坏死，同时保证坏死侧在修复过程中能产生类似人类的正常的生理应力[50]；②实验动物应选取与人亲缘性较好、接近人髋关节解剖生理学特点的哺乳动物，能够模拟人股骨头坏死从早期坏死改变到晚期塌陷的整个病理过程，同时也要考虑来源动物难易、是否经济可行等因素[51]；③尽量选择创伤性较低，动物死亡率低的造模方法，并能够较好控制造模时间，保证造模质量，提高实验可重复性；④实验动物体量适中，建立的动物模型应满足开展目前临床上常用的保髋手术治疗。
4 参考文献 References
略。