编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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导读
非编码RNA在人类生理及疾病发生发展中发挥重要的功能，其中长链非编码RNA（lncRNA）与micorRNA（miRNA）互为ceRNA，构成了相互作用网络，在转录及转录后水平上调控各种致病相关靶基因的表达。非酒精性脂肪肝（NAFLD）是由于除酒精摄入外的其他原因引起的肝细胞脂质堆积和肝脂肪变性，包括非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化，也成为近年来肝癌发病率升高的主要原因之一。基于前期发现了一种调节肝胆固醇代谢的新型长链非编码RNA（lncRNA）lnc-HC，本研究进一步阐明了lnc-HC的作用靶点之一是代谢性核受体MNR中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）。lnc-HC在mRNA和蛋白质水平上负调控PPARγ，而且这种调控作用是通过miR-130b-3p在转录及转录后水平实现的，lnc-HC/miR-130b-3p/PPARγ途径微妙地调控肝脏脂肪酸和甘油三酸酯（TG）代谢。本研究有助于进一步解析lncRNA和miRNA在肝脏脂质代谢中的调控模式，并可能为NAFLD的治疗提供新的靶点。原名：Long Noncoding RNA lnc-HC Regulates PPARγ-Mediated Hepatic Lipid Metabolism through miR-130b-3p译名：长链非编码RNA lnc-HC通过miR-130b-3p调节PPARγ介导的肝脏脂质代谢期刊：Molecular Therapy-Nucleic AcidsDOI号：10.1016/j.omtn.2019.10.018.本研究首先通过混合游离脂肪酸诱导大鼠肝癌细胞系CBRH-7919和正常肝细胞系BRL3A建立细胞模型，利用油红O染色观察细胞脂质的积累情况，利用qPCR（qPCR）检测了对应细胞中的目标长链非编码RNS lnc-HC及脂肪代谢和MNRs相关基因的表达水平。进一步构建lnc-HC的稳定过表达overLnc-HCCBRH细胞系和沉默Lnc-HCshRCBRH细胞系。qPCR和Western blotting检测其靶基因PPARγ等相关基因的mRNA和蛋白的表达水平。同时在Lnc-HCshRCBRH细胞中转染PPARγ小干扰RNA抑制其表达，检测其下游基因的表达，以明确lnc-HC对靶基因PPARγ的调控作用。为了研究其lnc-HC与靶基因PPARγ是否直接作用，在构建的两种lnc-HC过表达及沉默的细胞系中检测了PPARγ mRNA的半衰期，并利用RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull down验证两者互作关系。在发现没有直接互作的关系后，为了研究LncRNA的ceRNA作用模式，利用miRanda和TargetScan软件预测了调控PPARγ表达的miRNA候选物，通过qPCR筛选得到目标miRNA。进一步构建起目标miRNA的启动子区域的报告基因载体，进行双重荧光素酶报告基因检测，证实Lnc-HC与目标miRNA miR-130b-3p的互作关系。miR-130b-3p对靶基因PPARγ的表达调控的验证是通过转染模拟物mimics和抑制剂inhibitors进入CBRH-7919和BRL3A细胞系后检测靶基因PPARγ mRNA和蛋白的表达水平。进一步双荧光素酶报告基因检测证实了miR-130b-3p与靶基因PPARγ的3’UTR的互作关系。最后本研究在体外和体内两个水平上证实了lnc-HC通过miR-130b-3p实现调控靶基因PPARγ从而达到影响脂质代谢的作用。混合游离脂肪酸（FFA）诱导下CBRH-7919细胞中明显形成脂滴（图1A），qPCR结果脂质蓄积细胞出现相关基因的表达发生变化，包括脂质代谢酶脂肪酸合酶（Fasn；降低80％）、肉碱棕榈酰转移酶1A（Cpt-1a；增加7倍以上）、二酰基甘油O-酰基转移酶2（Dgat2;增加1.65倍），以及MNRs中的PPARα（减少25％）、PPARγ（增加1.8倍）、FXR（增加2.1倍）和Srebp1c（减少70％）（图1B和1C）。随着FAA处理时间lnc-HC增加，而其重叠基因Slc25a15的表达保持不变（图1D）。在FFA处理的BRL3A细胞中也观察到同样的现象，表明lnc-HC参与了肝脏FFA和甘油三酸酯（TG）代谢。图1. lnc-HC表达与CBRH-7919细胞中的脂肪酸代谢有关。（A）利用油红O染色媒介物或FFA处理24 h的CBRH-7919细胞。（B）qPCR检测CBRH-7919细胞Fasn、Cpt-1a、Dgat1和Dgat2的基因表达水平。（C）qPCR检测CBRH-7919细胞PPARα、PPARγ、FXR、LXRα和Srebp1c的基因表达水平。（D）qPCR检测0、3、6、12、24和48小时的CBRH-7919细胞lnc-HC和Slc25a15的表达水平。数据表示为平均值±SEM，差异显著性*表示p <0.05；**表示p <0.01；***表示p <0.001。通过过表达和沉默lnc-HC的overLnc-HCCBRH和Lnc-HCshRCBRH细胞系进一步检测相关基因的表达，结果表明在overLnc-HCCBRH细胞中PPARγ和LXRα的mRNA表达显著降低（图2A）。在Lnc-HCshRCBRH细胞中，仅PPARγ的mRNA增加（图2B）。Western blotting也表明lnc-HC可以负调控PPARγ蛋白的表达（图2C）。PPARγ全面调控TG的合成和储存过程。qPCR也表明与TG合成相关的基因（包括Acc2、Acsl1和Dgat2）受到lnc-HC的负调控，同时它们与PPARγ的差异表达一致（图2D）。另外，lnc-HC负调控FFA摄取基因Fatp-1和aP2，FFAβ氧化相关基因Cpt-1α（图2D）。通过在Lnc-HCshRCBRH细胞中转染PPARγ小干扰RNA，抑制PPARγ的表达（图2E和2F）发现，lnc-HC基因沉默导致的PPARγ下游基因表达水平的增加由于PPARγ的抑制降低了，包括aP2、Acc2、Dgat2和Fatp-1（图2G）。以上结果表明，lnc-HC负调节PPARγ及其通路基因的表达。图2. lnc-HC调控PPARγ表达及其信号传导途径。（A和B）qPCR检测基因表达，包括lnc-HC、Slc25a15、PPARα、PPARγ、FXR、LXRα和Srebp1。（A）是过表达lnc-HC的CBRH-7919，（B）是lnc-HC沉默的CBRH-7919细胞。（C）在lnc-HC-过表达/沉默的CBRH-7919中Western blotting检测PPARγ的蛋白表达（左）和量化直方图（右）。β-肌动蛋白为内参。（D）qPCR检测PPARγ靶基因的表达。（E和F）siNC或siPPARγ转染24 h的lnc-HC沉默细胞中PPARγ表达的qPCR（E）和Western blotting（F）。β-肌动蛋白为内参。（G）用siNC或siPPARγ转染24 h的lnc-HC沉默细胞中PPARγ靶基因表达的qPCR分析。数据表示为平均值±SEM，差异显著性*表示p <0.05；**表示p <0.01；***表示p <0.001。进一步检测lnc-HC干扰对PPARγ mRNA的半衰期的影响，结果表明lnc-HC的过表达降低了PPARγ mRNA的半衰期，而lnc-HC沉默则延长了PPARγ mRNA的半衰期（图3A），表明lnc-HC在转录后水平上负调节PPARγ的表达。前期研究发现lnc-HC通过与hnRNPA2B1蛋白直接相互作用来调节胆固醇分解代谢基因Cyp7a1和Abca1。本研究使用hnRNPA2B1蛋白的RNA免疫沉淀（RIP）表明hnRNPA2B1无法结合PPARγ的mRNA（图3B）。RNA pull down也证实在lnc-HC和核蛋白（NP）结合后，PPARγ mRNA与lnc-HC-NP复合物没有结合（图3C），而阳性对照Cyp7a1可直接与hnRNPA2B1相互作用。同时GFP-RIP后利用定量实时PCR也表明lnc-HC无法富集PPARγ的转录物（图3D）。众所周知，microRNA（miRNA）在转录后水平上调节基因表达。通过miRanda和TargetScan软件预测调控PPARγ表达的miRNA候选物，包括miR-130a-3p、miR-130b-3p、miR-301a-3p和miR-301b-3p（图3E）。定量实时PCR检测nc-HC干扰的CBRH-7919和BRL3A细胞系的相关miRNA的表达，结果显示只有miR-130b-3p的表达随着lnc-HC过表达而显着增加，随着lnc-HC沉默而降低（图3F和S3A）。而且lnc-HC沉默细胞中原始miR-130b（pri-）降低23％，前体miR-130b（pre-）降低50％，成熟的miR-130b-3p降低42％（图3G），表明miR-130b-3p从转录水平到转录后水平均受lnc-HC的调控。进一步通过双重荧光素酶报告基因检测证明，miR-130b-3p启动子活性随lnc-HC过表达而增加，随lnc-HC沉默而降低（图3H）。lnc-HC的二级结构包含一个5’端茎环、一个中央茎环和一个3’端茎环结果，双重荧光素酶报告基因检测证实Lnc-HC的5’端茎环（1-480 bp）对调控miR-130b-3p启动子活性至关重要（图3I）。图3. lnc-HC调节miR-130b-3p表达。（A）在lnc-HC过表达/沉默细胞中使用鹅膏蕈碱（50 mM）处理后PPARγ mRNA稳定性随时间（0、6、12和24 h）变化的定量实时PCR分析。（B）使用抗hnRNPA2B1抗体和IgG对RNRNPA2B1蛋白与lnc-HC或其他mRNA（包括PPARα、PPARγ、Cyp7a1和U6）之间的相互作用进行RIP检测。（C）RNA pull down检测lnc-HC、核蛋白（NP）和PPARα、PPARγ、Cyp7a1和U6的mRNA之间的相互作用。（D）抗GFP抗体、IgG和lnc-HC反义（AS）RIP检测lnc-HC与mRNA（包括PPARγ和U6）之间的相互作用。（E）miRanda和TargetScan软件预测的靶向PPARγ 3’UTR的候选miRNA及其结合序列。（F）lnc-HC干扰的CBRH-7919中相关miRNA表达的qPCR分析。（G）ln-HC干扰的CBRH-7919中miR-130a-3p和miR-130b-3p的原始、前体和成熟转录本的表达水平的qPCR分析。（H）通过双重荧光素酶报告基因检测lnc-HC干扰的CBRH-7919细胞中miR-130b-3p的启动子活性。（I）双荧光素酶报告基因检测lnc-HC截短（全长，480-1,410 bp和960-1,410 bp）后miR-130b-3p启动子活性。使用miR-130b-3p 模拟物和抑制剂检测miR-130b-3p和PPARγ表达之间的调控，发现模拟物显著降低了CBRH-7919细胞中PPARγ mRNA和蛋白的表达水平（图4A和4B）。相反，抑制剂导致PPARγ在mRNA和蛋白质水平上均升高（图4C和4D）。同样，miR-130b-3p可以强烈抑制PPARγ的表达，而miR-130b-3p抑制剂可以稳定BRL3A细胞中的PPARγ的表达。进一步构建报告基因载体pPPARγ-3’UTR-wild和pPPARγ-3’UTR-mut（图4E）进行双荧光素酶报告基因检测。结果表明在pPPARγ-3’UTR野生型转染组中，miR-130b-3p模拟物处理使相对荧光素酶活性降低，而抑制剂处理则使相对荧光素酶活性升高，而pPPARγ-3’UTR-mut转染组中没有以上差异（图4F）。以上结果证明了miR-130b-3p通过结合PPARγ 3’UTR降低PPARγ表达。与lnc-HC正调节miR-130b-3p表达的证据结合，可以表明lnc-HC通过转录后水平调控miR-130b-3p，实现对PPARγ表达的调控。图4. lnc-HC通过miR-130b-3p调控PPARγ的表达。（A）lnc-HC干扰的CBRH-7919中NCR模拟物或miR-130b-3p模拟物瞬时转染后PPARγ表达的qPCR分析。（B）在与（A）相同的条件下，PPARγ表达的Western blotting（左图）和定量直方图（右图）。（C）用NC抑制剂或各miRNA抑制剂转染后PPARγ表达的qPCR分析。（D）用iNC或miR-130b-3p抑制剂转染的CBRH-7919细胞中PPARγ表达的Western blotting（左图）和定量直方图（右图）。（E）靶向PPARγ 3’UTR的miR-130b-3p的野生型（Wt）和突变（Mut）结合位点的示意图。（F）转染mNC/miR-130b-3p模拟物或iNC/miR-130b-3p抑制剂的CBRH-7919细胞中PPARγ-3’UTR野生型和PPARγ-3’UTRmut的双重荧光素酶活性。5 lnc-HC/miR-130b-3p/PPARγ调节肝脏脂质代谢通过FFA处理后lnc-HC沉默可以增加细胞脂滴的含量（图5A和5B），细胞中FFA和TG的浓度也进一步增加（图5C和5D）。进一步分析载体和FFA处理对lnc-HC干扰的细胞中lnc-HC和PPARγ表达的影响，结果显示，FFA处理可上调PPARγ，而沉默lnc-HC会导致PPARγ显著增加。miR-130b-3p的表达与lnc-HC一致（图5E）。这些结果表明过度的FFA处理会增加lnc-HC和PPARγ的表达。如果lnc-HC没有上调，PPARγ可能会升高到更高水平并导致肝细胞中脂滴的过多积聚。为了验证lnc-HC/miR-130b-3p/PPARγ途径对肝脏脂质积累的影响，分别用FFA处理miR-130b-3p抑制剂转染过表达Lnc-HC的CBRH细胞和用miR-130b-3p模拟物转染的Lnc-HC沉默的CBRH细胞，结果表明脂滴含量随lnc-HC过表达而降低，而随着miR-130b-3p抑制剂转染lnc-HC过表达的CBRH细胞而增加（图5F和5G）。相反，在沉默lnc-HC的CBRH细胞系中，肝细胞脂质蓄积随着lnc-HC沉默明显增加，而随着miR-130b-3p模拟物的处理而减少（图5H和5I）。这些结果一致说明lnc-HC/miR-130b-3p途径在体外抑制肝细胞脂质的积累。（A和B）CFAH-7919、NCshRCBRH和Lnc-HCshRCBRH细胞用FFA处理12 h后细胞脂滴油红O染色（A）和使用ImageJ通过色密度扫描测量的结果（B）。（C和D）细胞内FFA（C）和TG（D）的浓度。（E）经过载体或FFA12小时处理lnc-HC沉默细胞的lnc-HC、PPARγ和miRNA的定量实时PCR分析。（F）用NC抑制剂或miR-130b-3p抑制剂转染过表达Lnc-HC的CBRH细胞24小时，然后用FFA处理12小时。油红O染色检测每组中脂滴的形成。（G）通过使用ImageJ测定细胞中相对脂滴含量的定量直方图。（H）在用NC模拟物或miR-130b-3p模拟物转染24小时，然后用FFA处理12小时，在沉默Lnc-HC的CBRH细胞中测量脂滴形成。（I）相对脂滴含量的定量直方图。高脂高胆固醇饮食诱导的HCD组和注射NCshR的HCD组大鼠肝脏中没有肉眼可见的脂滴积聚，但是注射Inc-HCshR的HCD组出现可见的肝脏脂肪变性（图6A）。与对照组相比，HCD组的血脂水平发生了变化，TG和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低。注射Inc-HCshR可以改善TG和HDL-C指标，但对LDL-C没有明显作用（图6B）。另外，与对照组相比，其他三个组的肝脏/体重比较高同时体重显著增加（图6C和6D）。与对照组相比HCD组大鼠肝脏中的TG浓度显着增加，而通过向HCD大鼠模型中注射lnc-HC shRNA与注射对照NCshR相比，TG浓度进一步增加（图6E）。lnc-HC表达在HCD组肝脏中增加，注射lnc-HC shR的HCD组中恢复到正常水平（图6F）。miR-130b-3p表达与lnc-HC完全同步（图6G）。另外，与NC组相比，HCD组中的PPARγ表达显着增加，而在注射lnc-HC shR的HCD组中，在mRNA和蛋白水平上PPARγ的表达均较高（图6H和6I）。同时注射lnc-HC shR后，lnc-HC的重叠基因Slc25a15明显降低。以上结果表明lnc-HC正调控miR-130b-3p，而lnc-HC/miR-130b-3p途径负调控PPARγ的表达。此外，lnc-HC/miR-130b-3p/PPARγ可以精确的调控肝细胞脂质的蓄积，可能是NAFLD的治疗靶标。图6. lnc-HC/miR-130b-3p途径调节肝脏脂质代谢。（A）HCD诱发脂质代谢障碍的E3大鼠模型肝切片的H＆E染色。（B）在HCD诱导的高脂血症模型结束时（E3大鼠，诱导8周），测量了TG、HDL-C和LDL-C的血清浓度。（C和D）第8周的肝脏/体重比（C）和体重增加量（D）。（E）肝TG浓度。（F和G）大鼠肝脏中lnc-HC表达（F）以及miR-130b-3p和miR-130a-3p表达（G）的qPCR分析。（H和I）肝PPARγ表达的qPCR分析（H）和Western blotting检测（I）。本研究证实了lncRNA在几乎所有生物学过程（包括肝脂质代谢）发挥调节作用，其调节模式有三种：首先lncRNA与特定蛋白直接相互作用，成为lncRNA蛋白复合体，并共同调控靶基因的表达；其次，lncRNA直接结合靶mRNA并调节mRNA的稳定性；第三，lncRNA和mRNA具有相同的识别元件miRNA并增加了miRNA调控网络的复杂性，称为竞争性内源性模式（ceRNA）。前期研究表明lnc-HC通过与辅助调控因子hnRNPA2B1直接相互作用导致Cyp7a1和Abca1的mRNA稳定性下降。但是本研究通过RNA pull down和RIP发现lnc-HC不通过lnc-HC蛋白或lnc-HC-mRNA模式调节靶基因PPARγ的表达，而是通过miR-130b-3p调节PPARγ表达，参与了转录及miRNA前体的加工。众所周知，miRNA表达的上游信号调节非常复杂，需要做进一步的研究以找出lnc-HC与miR-130b-3p之间的详细调控，才能进一步解析lncRNA的功能及miRNA的加工过程。同时本研究发现lnc-HC基因沉默可治疗体脂代谢紊乱。通过体外细胞培养及体内动物模型，发现lnc-HC在脂质代谢中的多功能性功能，对血脂异常中具有良好的作用，但在肝脏脂质代谢中具有副作用。通过脂类代谢相关基因表达水平及表型分析，发现发现lnc-HC防止脂滴过多积聚，从而保护肝脏。前期研究中发现LXR激动剂T0901317可以诱导lnc-HC，因此LXRs可能提供上游信号，驱动肝脏脂肪生成和lnc-HC过表达。同时研究发现lnc-HC/miR-130b-3p/PPARγ之间存在着微妙的平衡，与lncRNA和miRNA的微调控模式是一致的。因此本研究确定lnc-HC通过负调节PPARγ表达抑制肝中脂滴积累的功能和分子机制。在FFA处理下，上调的lnc-HC可保护肝细胞免于过度表达PPARγ，并有助于避免脂滴的过度形成和肝脏脂质的积聚。lnc-HC通过广泛而复杂的机制促进肝脏脂质稳态，为预防和治疗NAFLD开辟新的治疗策略。经过长期研究，人们对肝脏疾病的预防及治疗已取得重大进展，但肝脏作为“机体代谢中心”，其调节机制复杂，目前尚未完全阐明疾病的发病机制。lnc RNA在多种疾病的生理和病理过程中发挥重要的调控作用，也是继siRNA、microRNA之后又一热点的非编码RNA，可以作为疾病治疗的新突破口。本研究前期已经对lnc RNA lnc-HC在NAFLD中的调控作用有了较为深入的研究，发现其可以形成lncRNA蛋白复合体发挥对靶基因的的调控作用，但是进一步研究中发现有些靶基因的调控并不依赖lncRNA蛋白复合体，而是通过ceRNA模式，调控miRNA进一步调控靶基因，而这种调控作用在肝脏脂质代谢中维持微妙的平衡。这些发现丰富了lnc-HC在肝脂质代谢中的调控模式，并为改善脂质物质的体内平衡提供可能的治疗靶点。
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