科研 | Molecular Sciences：比较转录组分析提供了对低温胁迫下棉花种子萌发的见解（国人作品）
编译：凉风月，编辑：十九、江舜尧。
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低温胁迫影响陆地棉种子萌发，而其潜在分子机制不明，尤其是在转录组层面。在本研究中，研究者选取了两种广泛种植的棉花品种：耐低温型的KN27-3和低温敏感型的XLZ38进行了对比试验。分析了两种棉花种子萌发过程中的表型变化、转录组和激素水平的差异。结果表明，参与能量代谢的基因在萌发过程中显著富集，在低温条件下，KN27-3比XLZ38更早出现DNA整合、分生组织生长、子叶形态发生等生物学过程。编码抗氧化剂(亚精胺)和抗氧化酶的基因在KN27-3胚胎中的表达明显上调。IAA、CTK和GA3对耐寒品种萌发有促进作用，ABA对耐寒品种萌发有抑制作用。本研究从多个途径拓展了对棉籽萌发及其在低温条件下生理调控的认识，为后续揭示棉花种子对低温胁迫的调控机制做出了贡献。
论文ID
原文：Comparative Transcriptome Analysis Provides Insights into the Seed Germination in Cotton in Response to Chilling Stress
译名：比较转录组分析提供了对低温胁迫下棉花种子萌发的见解
期刊：Molecular Sciences
IF：4.183
发表时间：2020年3月
通讯作者：宋美珍、庞朝友、杨国正
通讯作者单位：中国科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室，华中农业大学植物科技学院长江中游作物生态生理与耕作系统教育部重点实验室
DOI号：10.3390/ijms21062067
实验设计
实验概述
研究内容
1.KN27-3和XLZ38在低温条件下萌发过程中的形态特征
研究者对21个不同棉花品种在低温条件下萌发过程中的下胚轴长度进行了调查，发现KN27-3和XLZ38的种子萌发速度差异巨大(图1a)。在正常条件下(28℃/25℃)，百粒重(图1b)和下胚轴长度(图1c)没有差异。在低温条件下(16°C/4°C)，KN27-3的下胚轴长度为0.94 cm，比吸胀后第6天的XLZ38长约30%。在第8天和第10天，长度差异变大。第12天，KN27-3的下胚轴长度比XLZ38长约45%(图1D)，说明KN27-3的耐寒性较强。
2. 低温条件下萌发早期的RNA-Seq分析及差异表达基因(DEGs)的鉴定
每个时间点，两个品种上设计3个生物重复，在5个吸胀时间点收集胚胎，共获得30个样本。通过RNA-Seq获得约1.41×109个原始读数，获得98.28%的clean read。通过将clean read与棉花参考基因组比对，共获得76331个基因的表达数据，然后利用拟南芥数据库BLAST算法确定棉花基因的功能注释。为了进一步鉴定与这两个品种表型密切相关的基因，通过比较KN27-3和XLZ38在5个吸胀时期的表达水平，进一步获得了差异表达基因(DEGs)。结果显示，相对于KN27-3, 在1-5期分别有1631，1597，1510，1161和933个基因显著上调，有1318、1149、1191、685和994个基因下调，共有7535个基因有差异表达(图2)。从第一阶段到第四阶段，上调的基因比下调的基因多。
3. 差异基因的KEGG通路分析
研究者对差异基因进行了KEGG通路分析，发现有20条通路在5个比较中显著富集（图3a）。碳代谢是最丰富的途径，包含194个差异基因，分别涉及“乙醛酸和二羧酸代谢”(47)、“糖酵解/糖异生”(71)、“柠檬酸循环”(38)和“半乳糖代谢”(38)。如图3b所示，参与糖酵解/糖异生的大多数DEGs在两个品种中的表达变化呈现出相同的动态趋势，但KN27-3在42和54h的表达增加显著高于XLZ38(图3b)。这些基因编码果糖-二磷酸醛缩酶(FBA)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油酸变位酶(PGM)。此外，在XLZ38中，在厌氧条件下酒精脱氢酶(ADH)编码基因在12、18和30 hpi（吸涨后小时数hours post imbibition，hpi）处的表达显著上调。糖酵解产生的丙酮酸(PEP)在有氧条件下进入三羧酸循环(TCA循环)和乙醛酸循环(GAC循环)。参与TCA循环的DEGs(图3c)在KN27-3中从42 hpi到54 hpi显著上调，如亚柠檬酸脱氢酶(IDH)、二氢硫代酰胺琥珀酰基转移酶(DLST)、富马酸酶(FUM)和苹果酸脱氢酶(MDH)。编码GAC特有酶的GAC(图3D)、异柠檬酸裂解酶(ICL)和苹果酸合成酶(MS)所涉及的DEGs在KN27-3中12和18 hpi显著上调，而MDH的表达从42 hpi持续增加到54 hpi。综上所述，KN27-3在吸胀初期(12~18 hpi)的能量来自GAC代谢，而XLZ38则可能来自有氧呼吸。在发芽后期(42~54 hpi)，KN27-3的能量来源于糖酵解和下胚轴伸长的TCA循环。
4. 差异基因GO富集分析
对从五个比较中获得的DEGs进行GO分析。结果表明，与种子萌发相关的生物学过程(BP)在KN27-3早期显著富集，表明KN27-3发育较XLZ38快。图4显示了KN27-3中上调的基因富集的GO术语，这在下调的基因富集结果中不存在。种子吸水12h后，DNA整合和RNA组装富集。胚胎中有丰富的无氧呼吸和乙醛酸代谢。18hpi时DNA修复，液泡形成，种子由无氧呼吸转为有氧呼吸，分生组织细胞开始分化形成新器官，DNA开始复制，30hpi时有丝分裂激活。此外，叶绿素合成和光形态建成也显著丰富。到42h，KN27-3下胚轴开始发育，花药和雌蕊开始发育。在最后54hpi，分生组织继续生长，KN27-3开始形成子叶(图4)。XLZ38自始至终都有类似的生长模式，但与KN27-3相比有所延迟。
5. 与渗透调节相关的差异基因
在开始低温后，植物往往会增加渗透相关物质的积累，以减少水分损失。研究者对渗透调节相关基因进行了分析。根据GO富集结果分析，KN27-3在所分析的5个阶段都有天冬酰胺的生物合成，而XLZ38仅在30 hpi时才有天冬酰胺的生物合成。谷氨酰胺依赖的天冬酰胺合成酶1(ASN1)是植物氮代谢循环中的重要酶，也是天冬酰胺合成的关键酶。ASN1(Gh_A09G2475)在KN27-3细胞12~30 h的表达明显高于XLZ38细胞，但此后略有下降，而XLZ38细胞维持在较低水平(图5a)。天冬氨酸氨基转移酶1(Asp1)(Gh_A09G0035)在KN27-3和XLZ38中的表达在42 hpi时显著增加，在54 h时保持在相似的水平，但在KN27-3中的FPKM值在42和54 h时几乎是XLZ38的两倍(图5b)。在KN27-3中，天冬氨酸转氨酶1(Asp1)的表达量(Gh_A09G0035)在42 hpi和54 h时均显著增加，并在54 h时保持在相似水平。
种子萌发伴随着可溶性糖的合成和分解代谢。在KN27-3中GDP-甘露糖生物合成过程和海藻糖生物合成过程伴随相关基因的高上调在12 hpi时富集。CYT1编码一个GDP-甘露糖焦磷酸化酶/甘露糖-1-焦磷酸酶，TPS11编码一个可能参与海藻糖生物合成的酶。在KN27-3中，CYT1和TPS11在12 hpi时表达量较高，然后随着发芽时间的延长而降低(图5c、d)。棉子糖分解过程在除第4阶段外的所有阶段都在KN27-3中活跃，富含的基因在XLZ38中均上调表达。SIP2编码棉子糖特异的α-半乳糖苷酶，催化棉子糖分解为α-半乳糖和蔗糖。在整个萌发过程中，XLZ38的表达量均高于KN27-3(图5e)。在12~30 hpi范围内，合成代谢相关基因和分解代谢相关基因的表达水平均较高。因此，在KN27-3中参与甘露糖、海藻糖和棉子糖生物合成的基因的早期上调可能会对冷胁迫提供有用的保护。
6.与抗氧化剂和抗氧化酶的合成相关差异基因
抗氧化剂在植物抵御低温方面起着重要作用。研究者对抗氧化剂生物合成相关基因的表达进行了分析。主要基因如图6所示：在KN27-3中，精胺生物合成过程和多胺生物合成过程在54 hpi时显著富集。与XLZ38相比，KN27-3在54 h时其表达明显上调(图6a)。此外，编码精胺合成酶(SPMS)的在KN27-3的42和54 hpi处的表达水平高于XLZ38，且保持不变(图6b)。
过氧化氢酶同工酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽S-转移酶(DHAR)和L-抗坏血酸过氧化物酶(APX)在萌发过程中被激活。在12 hpi时，CAT1、Gpx4和DHAR2在KN27-3中高表达(图6c-e)。APX1在42~54 h有较高的FPKM值(图6f)。编码抗氧化剂合成和抗氧化活性的酶的基因在KN27-3中高表达的两个品种中表现出相似的趋势。
7．内源性激素含量及其相关基因表达
植物激素对种子发育和对低温胁迫的响应非常重要，为此，采用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)测定了种子萌发5个阶段的内源激素含量。如图7a所示，KN27-3在所有时间点都检测到较高的IAA含量，在30 hpi时最高含量为157.40 ng/g，约为XLZ38的4倍。与XLZ38相比，KN27-3中CZR和tZR的积累也更多(图7b，c)。42 hpi时，两品种胚中GA3含量(图7d)差异较大，KN27-3的GA3含量是XLZ38的3倍左右。而XLZ38的ABA含量在5个发芽阶段均高于KN27-3，在12、42和54hpi时差异显著(图7e)。
研究者还鉴定了参与CKT、GA和ABA代谢的DEGs，它们在种子萌发过程中的变化与激素的积累是一致的。TP/ADP异戊烯基转移酶2(IPT2)催化CTK生物合成的限速步骤。其编码基因在KN27-3中的FPKM值高于在XLZ38中的FPKM值，表达在30 hpi时达到峰值，之后下降(图7f)。此外，参与CTK降解的氧化酶/脱氢酶编码基因在XLZ38中表达上调，在12 hpi和42 hpi时显著高于KN27-3(图7g)。编码GA20氧化酶的同源基因在萌发过程中表达。它与GA的生物合成有关。在12 hpi和18 hpi时，GA20氧化酶在KN27-3中的表达量显著高于XLZ38。在KN27-3中，其在XLZ38中的表达在54 h稳定，但与42 h相比显著下调(图7h)。脱落酸8’-羟化酶1(CYP707A1)是ABA失活的重要酶。GH_A08G1344在XLZ38中从30到42h下调，而KN27-3无变化。在两个品种中，它的表达都是先上升后下降，持续18 h，但XLZ38的下降速度比KN27-3快(图7i)。综上所述，这些基因在两个品种中的表达动态与激素积累动态是一致的。IAA、GA3和CTK在低温萌发过程中对KN27-3起正向调节作用，ABA对KN27-3起负向调节作用。
讨论
在本研究的基础上，KN27-3和XLZ38的种子发芽率在低温条件下表现出显著的差异，表明它们对低温的反应不同。结果表明，KN27-3对低温的早期快速反应对其下胚轴伸长起着重要的促进作用。KN27-3保证了胞内环境的稳定性，减少了低温伤害。ASP1和ASN1在KN27-3萌发过程中有较高的表达水平。ASP1和ASN1分别催化天冬氨酸和天冬酰胺的产生。本研究结果表明，KN27-3种子萌发过程中产生较多的天冬氨酸和天冬酰胺，调节细胞渗透压，除产生较多的铵离子外，还可能保护种子的萌发过程不受低温胁迫的影响。
两个品种在萌发过程中都丰富了海藻糖和GDP-甘露糖的生物合成过程。编码甘露糖焦磷酸化酶/甘露糖焦磷酸化酶的CYT1在KN27-3中18 h有较高的表达水平。有研究表明GMPase在烟草中的过表达降低了高温或低温胁迫下植株中H2O2和O2−的含量。KN27-3中GMPase的表达显著上调，这可能减轻了胁迫诱导的过氧化损伤，并产生了细胞壁的结构成分GDP-甘露糖。碳水化合物是合成海藻糖的底物。含有累积海藻糖的鹰嘴豆在最佳温度条件和低温胁迫下都表现得更好，因为海藻糖保护植物免受氧化损伤，并有助于保持碳的同化和幼苗的生长。在本研究中，与ASN1和CYT1相似的4个TPS11/9同源基因在KN27-3中12~30 h有较高的表达水平。TaTPS11转录水平与植物耐冷性呈正相关。冷胁迫诱导的棉子糖合成可以调节植物的抗寒性。棉子糖家族低聚糖(RFO)促进种子萌发。棉子糖的分解代谢几乎富集到整个吸胀过程。XLZ38的棉籽糖分解程度高于KN27-3，这可能导致KN27-3的棉籽糖含量较高，从而提高了抗逆性(图5e)。因此，在吸胀阶段，KN27-3可能会合成更多的GDP-甘露糖和海藻糖，而在种子萌发的早期(12~30 hpi)可能会分解更多的棉子糖，这有助于种子萌发过程中在低温条件下的渗透适应。
胚胎发育通常与活性氧(ROS)的积累有关。在低温胁迫下，组织中也会产生ROS。更多的ROS积累会对蛋白质、脂质、核酸等生物大分子造成不同程度的损伤，可能导致生物膜流动性的改变和生物酶的失活，阻碍蛋白质的合成和降解，造成DNA损伤等。因此，有效的抗氧化机制被认为是获得健壮种子的前提。低温胁迫造成的损害与植物细胞内氧化系统失衡有关。所有的多胺都有结合DNA进行保护的能力。它们还通过最小化氧化损伤和维持膜结构来提高植物的抗逆性。亚精胺(Spd)在低温下能促进植物种子萌发。在本研究中，参与SAMDC和SPMS的DEGs在两个品种中都有表达，但在种子萌发过程中，KN27-3的表达量高于XLZ38。多项研究表明，Spd通常与下胚轴伸长率相关。因此，在低温条件下，SAMDC和SPMS的高表达可能会增加KN27-3种子萌发中Spd的积累。
抗氧化酶活性的微调调控可能参与了KN27-3在低温条件下促进下胚轴伸长的过程。KN27-3中CAT1、Gpx4、DHAR2和APX1的表达高于XLZ38(图6)。CAT1和Gpx4的快速高效表达在12hpi时更明显，APX1在以后的时间点(42和54 h)表达更强，DHAR2在整个萌发阶段(12、42和54 h)都有表达。Gpx4存在于不同的细胞隔间，它与SOD和CAT1等酶密切合作，协调和消除植物中过量的自由基，提高植物的抗性。在干旱和低温胁迫条件下，谷胱甘肽(GSH)和APX负责清除干旱和低温诱导的ROS解毒，它们的表达促进了更高的发芽率，增加了根长和更高的鲜重积累。研究表明，较高的CAT活性可以降低植物中的H2O2含量，而提高CAT活性可以提高水稻的耐受性和种子在低温下的发芽率。结果表明，KN27-3比XLZ38具有更强的缓解低温胁迫下ROS危害的能力，证明抗氧化剂的快速积累是决定棉籽耐冷性的重要因素。
各种研究表明，植物激素调节种子萌发。ABA和GAs起着最重要的作用，IAA存在于萌发过程中和萌发后的胚根尖端，CTK在萌发过程中被激活。本研究的数据表明，在低温胁迫下，KN27-3在萌发过程中积累了IAA和CTK，这有助于保证胚的生长(图7a-c)。当植物受到压力时，它们通过平衡IAA和CTK激素途径以及ROS信号来维持生长。IPT2催化戊烯基化tRNA的分解，这是CZT合成的关键步骤。玉米素顺反异构酶活性的出现表明，tRNA介导的途径也可能有助于通过Cz型CKS合成TZ型CKS。CKX酶通过氧化侧链断裂催化CTK的可逆降解。结果表明，编码IPT2的基因和编码CKX的基因在KN27-3中分别上调和下调，从而产生更多的CTK。在双子叶植物的萌发过程中，GA主要通过促进胚根的伸长和种皮的穿透来促进萌发。结果表明，KN27-3中GA3的积累在30 h开始增加，42 h显著高于XLZ38，编码GA20ox1B基因的表达也在42 h显著增加，54 hpi时有显著差异(图7d，h)，表明KN27-3中GA3的积累在30 h开始增加，42 h时GA20ox1B的表达量显著高于XLZ38(图7d，h)。说明GA3的合成正向调控了KN27-3在低温胁迫下的萌发过程。脱落酸(ABA)是一种重要的植物激素，调节植物的生长发育以及非生物和生物胁迫反应。ABA在发育中的胚中积累，调节种子发育、种子成熟和种子休眠。XLZ38的ABA内源含量较高(图7E)。
CYP707A1是两个重要的ABA分解代谢基因之一。GH_A08G1344转录水平在XLZ38萌发过程中下调(图7I)。推测ABA抑制种子萌发，IAA、CTK和GA3正向调控种子萌发，提示激素和代谢基因转录共同调控种子萌发过程。
两个品种参与代谢的抗氧化酶和催化酶在同一温度下的转录表达水平不同。在接下来的研究中，研究者将继续研究同一温度下不同品种抗氧化酶活性差异的原因，探索低温条件下棉籽中抗氧化酶活性水平与H2O2含量和O2−含量的关系。
结论
本研究利用GO富集和KEGG途径分析，共鉴定了7535个差异基因，分析了它们在KN27-3和XLZ38之间5个吸胀阶段的潜在作用。KN27-3(耐寒基因型)IAA、CTK、GA含量升高，ABA含量降低，可能通过相互作用改变能量代谢，维持氮碳平衡，从而促进种子萌发。KN27-3基因型的天冬酰胺、GDP-甘露糖、海藻糖和棉子糖的代谢过程、精胺的快速积累和较高的抗氧化酶活性可能是其在低温胁迫下表现改善的原因。
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