编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
萝卜（Raphanus sativus，2n = 2x = 18）是一种重要的十字花科块根类蔬菜，肉质直根是其主要产品器官，决定经济价值。然而，萝卜等块根类蔬菜的主根增厚的分子机制仍远未完全阐明。随组学方法的迅速发展，RNA-seq成为识别植物不同组织器官和发育阶段调控基因和途径的重要方法，如月季花、大豆、甜橙、杨梅、番茄。先前研究对萝卜主根增厚过程中基因表达和复杂调控网络进行了探究。研究表明萝卜主根增厚过程中，许多miRNA和mRNA差异表达。在主根增厚过程中，碳水化合物代谢途径显著激活，尤其在细胞增殖组织中。根的形状和大小（根型）在不同品种间存在显著差异，与根型差异相关的基因是促进或抑制萝卜主根增厚的候选基因。而目前没有萝卜品种主根发育相关基因鉴定的报道，限制了萝卜品种的遗传改良和种质创新。本研究用三种不同根型的自交系（大针状NAU-DY、倒卵形NAU-YB、小圆形NAU-YH）的三个发育阶段，识别参与主根增厚的差异表达基因（DEG）和差异表达miRNA（DEM）。研究结果揭示了萝卜主根增厚的关键基因和miRNA，为其动态调控提供新见解。
原名：Genome-wide sRNA and mRNA transcriptomic profiling insights into dynamic regulation of taproot thickening in radish (Raphanus sativus L.)
译名：sRNA与mRNA转录组揭示萝卜主根增厚的动态调控机制DOI号：10.1186/s12870-020-02585-z
① 植物材料（图1）。三种萝卜自交系（大针状NAU-DY、倒卵形NAU-YB、小圆形NAU-YH），三个发育阶段分别为皮质分裂前期（PSS，两叶幼苗）、皮质分裂期（CSS，皮质分裂）、扩张期（ES，主根增厚率最高）。
② 转录组测序与分析（图2）。mRNA reads质控后利用TopHat2在参考序列上拼接，采用FPKM方法计算基因表达水平，DEGseq筛选差异表达基因（DEG）。sRNA reads通过Bowtie比对至参考基因组，过滤rRNAs、tRNAs、snRNAs、snoRNAs，通过miRBase21进行鉴定，通过miREvo和mirdeep2预测新型miRNA。DESeq鉴定差异表达miRNA（DEM）。psRobot预测miRNA靶基因，GO/KEGG分析其生物学功能富集。
图1 本研究的三种萝卜品种的生长发育特性。a: NAU-DY, b: NAU-YB, c: NAU-YH, d: 生长发育曲线。
1、主根增厚三个发育阶段的差异表达miRNA（DEM）三个发育阶段的两两对比分别有77、85、56个DEM（图3）。与皮质分裂前期相比，皮质分裂期发现28个miRNA上调，49个miRNA下调，扩张期发现26个miRNA上调，59个miRNA下调。DS2 vs DS1、DS3 vs DS1、DS3 vs DS2中分别只有8个、7个和3个miRNA特异表达。NAU-YH与NAU-DY有16个相同的DEM，miR394a、miR408-5p、miR828在NAU-YH和NAU-DY中表达模式相似，而在三个发育阶段均差异表达（表1）。与NAU-YH相比，NAU-DY有12个DEM在主根增厚过程特异差异表达，表明miR394a、miR408-5p、miR828可能参与了主根增厚，而miR395a可能与根型差异有关（表2）。
YB_S2 vs YB_S1、YB_S3 vs YB_S1、YB_ S3 vs YB_S2的差异表达基因总数分别为4131、4979、1635个，DY_S2 vs DY_S1、DY_S3 vs DY_S1、DY_S3 vs DY_S2分别鉴定2499、3970、1924个DEG。NAU-YB与NAU-DY共有DEG共2606个，NAU-YH中存在更多DEG，表达模式比NAU-YB和NAU-DY多样化。对共有的2606个DEG进行GO富集分析，表明'纤维素微纤维组织’、'细胞生长’、'碳水化合物生物合成’、'腺苷甲硫氨酸生物合成’在第一和第三发育阶段富集（表3）。KEGG分析表明淀粉和蔗糖代谢、苯丙素生物合成、硫代葡萄糖酸盐生物合成、硫胺素新陈代谢相关基因参与主根增厚的关键途径。因此，萝卜主根增厚过程是促进细胞生长和器官增大的物质和能量代谢过程。
表3 NAU-DY与NAU-YB共有DEG的GO富集分析。
表4 NAU-DY与NAU-YB共有DEG的KEGG富集分析。psRobot软件根据NAU-DY的sRNA数据预测1280个靶点。miR156a-3p、miR159b-3p、miR159c、miR5658、miR827、miR828、miR858a、miR858b靶向MYB结构域基因。与NAU-YH相比，NAU-DY有12个DEM，其中包括miR167c-5p（靶向ARF8）、miR393a-5p（靶向bHLH77）、miR5658（靶向APL）。从差异表达基因中选择20个进行RT-qPCR分析。结果表明RsAIR12、RsAUX1（生长素转运蛋白）、RsPIN3（生长素外排载体成分）、CYP79F1（高蛋氨酸N-羟化酶）、GLT1（谷氨酸合成酶）、GSTF3（谷胱甘肽s-转移酶）、BFRUCT4（呋喃果糖苷酶）在皮质分裂前期表达较高，IAA26（生长素响应蛋白）和SUS1（蔗糖合酶）在皮质分裂期表达较高，EXPB3（扩张蛋白）、CDC5（细胞分裂周期蛋白）、SPS1（蔗糖磷酸合成酶）、JAL34（植物血凝素）、JLN1 2（谷氨酰胺合成酶胞质同工酶）、ASPG2（天冬氨酸蛋白酶）、APA1（天冬氨酸蛋白酶）、BAM5（淀粉酶）、PPC2（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）、AGPS1（磷酸腺苷酰基转移酶）在扩张期表达较高（图4）。从表达水平可看出miRNA与其相应靶点（miR167-ARF8、miR393-bHLH77、miR5658-APL）呈负相关，表明miRNA介导的基因沉默参与萝卜主根增厚。
图4 与主根增厚有关的DEG表达水平RT-qPCR验证。萝卜主根增厚具有复杂的分子调控机制，在萝卜中参与形态形成的物质包括蔗糖、淀粉、蛋白质等，都是根的形成和发育所不可缺少，并有一系列基因如SUS1、SUS3、SUC1、SUC2参与这些过程，其中SUS1对萝卜主根增厚有促进作用。涉及植物激素生物合成和信号转导的基因包括生长素的SAUR40、IAA26、IAA3、IAA7、细胞分裂素的LOG8、CKX6、赤霉素的GA2ox1、GA3ox2、RGA2是萝卜主根增厚信号转导过程中的重要调控因子。细胞周期受F-box蛋白CYCU4 1、CYCD3 1、CDC5和激酶KRP5调控，它们决定萝卜主根增厚的细胞数量。细胞扩张受扩张素蛋白EXPA9、EXPB1/3、木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶蛋白XTH9、XTH7、根细胞伸长因子COBRA调控，这些蛋白在主根增厚过程中决定细胞大小。此外，一些转录因子包括bHLH（bHLH77、bHLH96、bHLH148）, MYB（MYB4, MYB28 MYB44）和WRKY（WRKY12, WRKY19 WRKY33）可能在萝卜主根增厚中发挥重要作用。共有45个基因在3个不同根粗的萝卜自交系中差异表达，其表达模式如图5所示。结果表明大多数DEG具有相似的表达模式，而一些DEG如SUS1、SUC1、EXPB3、EXLA2、ERF109表现出不同的表达模式。GA3ox2（赤霉素氧化酶）、CKX6（细胞分裂素氧化酶）、miR167c-5p（靶向ARF8）、miR393a-5p（靶向bHLH77）在NAU-DY中特异差异表达。蔗糖（蔗糖代谢的关键基因SUS1）作为信号分子可诱导miR393-bHLH77特异性表达，进而调控下游基因在萝卜主根增厚过程中对细胞分裂起重要作用。一些参与生长素生物合成和信号转导的基因miR167- ARF8、CKX6)和GA3ox2调控多个功能基因COBRA、EXPB1/3、CDC5，可能在萝卜主根增厚和发育过程中起作用。
图5 萝卜主根增厚和发育的推测调控模型。A：3个萝卜自交系共有DEG的表达模式热图；B：DEM及其相应靶基因的表达谱；C：萝卜主根增厚和发育调控模型。结合mRNA-seq和sRNA-seq的方法为挖掘潜在的关键基因和揭示复杂的性状调控网络提供有效线索。萝卜主根增厚是一个复杂的生物过程，包括一系列物质积累和信号转导途径。由于肉质根的大小不同，本研究选用了三个具有代表性的萝卜自交系，系统描述了涉及主根形成的潜在关键基因。本研究认为与根型差异相关的基因是促进或抑制萝卜主根增厚的候选基因。研究表明在瘦根型萝卜中木质素生物合成途径参与萝卜主根增厚过程。此外，与乙烯产生和根毛伸长相关的基因在瘦根中也过表达，其原因可能是乙烯和侧根的发育抑制了主根细胞伸长。本研究的12个DEM，miR165、miR167、miR319、miR5658、miR8175、miR857、miR170、miR393在萝卜NAU-DY根增厚过程中特异性表达差异，可能与根型变异有关。碳水化合物代谢在增厚的根中显著激活，尤其是细胞增殖组织，其中SUS1的表达水平与根增厚率相关。本研究中碳水化合物代谢过程富集于所有萝卜品种，这表明碳水化合物代谢对主根增厚可能是至关重要。而SUS1基因在三种萝卜自交系中表现出不同的表达模式。大针状萝卜中SUS1的表达水平在皮层分裂期达到高峰，远高于中倒卵形萝卜和小圆形萝卜，说明SUS1可能在主根增厚过程中发挥重要作用，特别是对大针状萝卜。细胞分裂和细胞扩张促进植物的生长发育，植物细胞壁为植物体提供了基本支撑，并决定细胞的大小和形状。作为细胞壁的主要成分，纤维素微纤丝的组织结构是细胞扩张的决定因素之一。本研究在S3 vs S1比较中发现纤维素微原纤维组织显著富集，2个COBRA和3个COBRA类基因存在差异表达。先前研究表明COBRA参与纤维素的合成，控制细胞壁中纤维素的含量和细胞定向伸长的功能。而本研究发现S3 vs S1中COBRA基因均上调，而COBRA类基因均下调。本研究表明大针状萝卜和倒卵形萝卜共有2606个差异表达基因，它们在苯丙类生物合成、硫代葡萄糖苷生物合成以及淀粉和蔗糖代谢途径中显著富集。大针状萝卜和倒卵形萝卜共有16个差异表达miRNA，miR393a-bHLH77、miR167c-ARF8和miR5658-APL可能是主根型变异的关键因素。本研究的转录谱系统研究可以为全面理解根系作物主根增厚的分子调控机制提供新见解。
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