科研 | Plant Cell：油菜素类固醇介导转录因子BES1抑制植物类黄酮生物合成、协调生长和紫外线胁迫响应(国人佳作）
编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Brassinosteroid-Activated BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1 Inhibits Flavonoid Biosynthesis and Coordinates Growth and UV-B Stress Responses in Plants
译名：油菜素类固醇介导转录因子BES1抑制植物类黄酮生物合成、协调生长和紫外线胁迫响应
期刊：Plant Cell
IF：9.618
发表时间：2020.08
通讯作者：刘宏涛
通讯作者单位：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
DOI号：10.1105/tpc.20.00048
实验设计
① 植物材料。拟南芥野生型（Col-0），突变株（uvr8-6、myb11/myb12/myb111、BES1-RNAi、bes1-D、bri1、bin2），表达载体（Pro35S::BES1-Flag、bes、pBES1::LUC）。10d幼苗进行UV-B胁迫8h，进行表型分析。测定光系统II的最大量子产额（Fv/Fm）。
② 生化分析。HPLC测定黄酮醇含量，DPBA染色法对黄酮醇含量原位分析，UPLC-MS/MS分析内源BR含量。
③ 基因调控分析。在烟草上进行瞬时转录荧光素酶活性测定BES1启动子表达活性。染色质免疫沉淀检测BES1基因结合的DNA序列。电泳迁移率变动分析验证BES1蛋白与MYB11/12/111启动子的互作。
④ 转录组分析。对比bes1突变体与野生型在UV-B胁迫下的转录本，筛选差异表达基因进行GO富集。
结果
1、BR负调控UV-B胁迫耐受性
图1 BR负调控UV-B胁迫耐受性。A-B：bes1突变株UV-B胁迫耐受性表型及PSII最大量子产额（Fv/Fm）；C-D：bes1过表达株UV-B胁迫耐受性表型及PSII最大量子产额（Fv/Fm）；E-F：bri1突变株UV-B胁迫耐受性表型及PSII最大量子产额（Fv/Fm）。
2、BES1抑制MYB转录因子表达，抑制黄酮醇生物合成
BES1是BR信号通路中的关键转录因子，调控许多基因的表达。被BES1上调的基因中，细胞壁生物合成相关基因显著富集（图2A），说明BES1促进植物生长。被BES1下调的基因中，类黄酮生物合成相关基因富集最显著（图2B）。这些类黄酮合成基因被BES1下调，但被UV-B显著诱导（图2C），包括黄酮醇合成酶1 （FLS1）、查尔酮合成酶（CHS）、黄酮3-羟化酶（F3H）、MYB12，说明UV-B和BES1拮抗调节类黄酮合成基因表达。
BR调节查尔酮合成酶和花青素合成，但BR是否调控黄酮醇生物合成尚不清楚。类黄酮的生物合成涉及多种酶和调控蛋白，PFG1/MYB12、PFG2/MYB11、PFG3/MYB111是激活黄酮醇生物合成基因表达的主调控因子。qPCR结果表明与野生型相比，这3个PFG/MYB基因在BES1-RNAi植株中表达上调（图2D）。因此，BES1抑制PFG/MYB转录因子的转录。
BES1抑制PFG/MYB基因转录表明BES1可能影响内源性黄酮醇水平。本研究用HPLC分析植物中黄酮醇含量。结果表明UV-B胁迫下BES1-RNAi、bri1-301和det2的黄酮醇含量高于野生型（图2E）。进一步采用DPBA染色原位分析黄酮醇含量。与HPLC结果一致，UV-B处理后uvr8中黄酮醇含量较低，BES1-RNAi和bri1-301中黄酮醇含量较高。因此，BES1下调PFG/MYB的表达，抑制黄酮醇的积累。
图2 BES1抑制PFG/MYB基因表达和黄酮醇生物合成。A-B：被BES1上调与下调的基因GO富集分析；C：UV-B胁迫下BES1调控的类黄酮相关基因表达；D：RT-qPCR分析野生型和BES1-RNAi突变体中PFG/MYB基因的表达；E：HPLC测定UV-B胁迫下幼苗黄酮醇水平。
3、BES1在BR诱导下直接与PFG/MYB启动子结合
研究表明BRRE元件(CGT GT/CG)和G-box元件(CACGTG)经常在BR抑制的靶基因启动子中富集。本研究发现PFG/MYBs启动子存在G-box和BRRE元件，G-box元件明显多于BRRE元件（图3B-D）。电泳迁移率变动分析表明BES1可与MYB11、MYB12和MYB111的启动子结合（图3A）。染色质免疫沉淀分析表明BES1与这些PFG/MYB启动子结合，而有些结合位点含有G-box，有些则没有。本研究还使用一种BES1抗体对来自野生型的免疫沉淀BES1-DNA复合物进行了共沉淀分析，证实BES1确实与PFG/MYB的启动子结合（图3E）。
根据传统BR信号通路，BES1对BR的响应是去磷酸化，去磷酸化后的BES1与生长相关基因结合，激活表达。与磷酸化的BES1相比，去磷酸化的BES1对PFG/MYB有更高的结合亲和力，BES1靶基因SAUR-AC（阳性对照）也得到类似结果（图3F）。因此，BR促进了BES1与PFG/MYB启动子结合。双荧光素酶（LUC）报告质粒表明，35S启动子驱动下，BES1基因高表达，而BES1显著抑制荧光信号，说明BES1抑制了PFG/MYB基因的转录（图3H-J）。因此，BES1以BR介导的方式直接与PFG/MYB启动子结合，从而抑制PFG/MYB的转录。
先前研究表明UVR8与BES1相互作用，抑制其与植物生长相关基因（如SAUR-AC）的结合，从而抑制表达和BR促进的下胚轴伸长，因此在这里探究UV-B对BES1与PFG/MYB启动子结合的影响。然而结果表明UV-B没有影响BES1对PFG/MYB启动子的结合活性（图3G）。因此，UV-B和UVR8并不影响BES1对PFG/MYB基因的DNA结合活性，UV-B可能通过其他机制影响BES1对PFG/MYB基因表达的调控。
由于BES1直接抑制PFG/MYB基因表达，抑制黄酮醇的生物合成，我们推测PFG/MYB作用于BES1下游调控UV-B胁迫响应。本研究将myb11、myb12、myb111三突变体（简称mybt）与BES1-RNAi或bri1-301杂交，得到BES1-RNAi+mybt和bri1+mybt突变株。与野生型相比，mybt的黄酮醇含量显著降低。BES1-RNAi的黄酮醇含量高于野生型，而BES1-RNAi+mybt的黄酮醇含量显著低于BES1-RNAi（图4A）。这些结果表明MYBs在BES1的下游起调控黄酮醇积累的作用。BES1-RNAi+mybt对UV-B胁迫敏感，抑制BES1-RNAi耐受UV-B的表型（图4B-C）。UV-B处理下bri1+mybt黄酮醇含量明显低于bri1-301，且bri1+mybt对UV-B胁迫敏感，说明bri1-301耐受UV-B的表型依赖于MYB。
图3 BES1在BR信号介导下与PFG/MYB基因启动子结合。A：电泳迁移率转移分析，两个箭头表示两个不同的BES1-MYB探针结合物；B-D：PFG/MYB的ChIP-qPCR启动子分析，红圈表示G-box元件，蓝圈表示BRRE元件，字母表示qPCR扩增片段；E：野生型和BES1-RNAi转基因株的ChIP-qPCR检测；F：BR处理促进BES1与MYB启动子的相互作用；G：UV-B处理不影响BES1与MYB启动子的相互作用；H：MYB启动子驱动的LUC报告质粒结构；I-J：BES1抑制MYB的表达。
图4 PFG/MYB作用于BES1的下游，调节UV-B胁迫耐受性。A：用DPBA对叶子的黄酮醇进行染色，荧光显微镜对其进行成像；B-C：BES1-RNAi+mybt突变株的表型分析及Fv/Fm测量。
4、BES1在UV-B胁迫时下调
UV-B处理对BES1与PFG MYB基因启动子的结合活性无显著影响。且UV-B胁迫对BR生物合成基因DWF4、CPD和BR6OX2表达影响不大，只是略有下降。通过测量UV-B处理后植株内源BR水平，包括油菜素甾酮（CS）、香蒲甾醇（TY）等，表明TY水平没有显著变化，而CS水平略有下降。
研究表明宽波段UV-B（280-315 nm）比窄波段UV-B（311-313 nm）更易引起应激。而窄波段UV-B对BES1转录和蛋白稳定性没有显著影响。本研究中，野生型和uvr8株中，UV-B处理使BES1蛋白水平下降（图5A）。虽然BR活化的去磷酸化BES1与PFG MYBs的结合亲和力比磷酸化的BES1高，但UV-B处理后磷酸化和去磷酸化的BES1水平均下降。RT-qPCR显示UV-B处理后BES1转录水平均下降（图5B）。因此，UV-B胁迫以一种不依赖uvr8的方式抑制BES1转录。在UV-B胁迫下，BES1、BEH1、BZR1转录水平下降，BEH2和BEH4转录水平没有变化，BEH3转录水平上升。因此，UV-B通过不同机制调控BES1及其同源基因。
为证明UV-B胁迫对BES1转录的影响，通过pBES1::LUC转基因植株，其中的荧光素酶基因（LUC）由BES1启动子驱动，分析植株中的LUC信号。结果表明宽UV-B显著降低LUC信号，而窄UV-B对LUC信号影响不大（图5C）。宽波段UV-B对BES1和BR诱导的BES1去磷酸化没有影响，说明UV-B胁迫主要抑制BES1转录，而不是蛋白稳定性和BES1磷酸化。
图5 BES1受UV-B胁迫下调。A：免疫印迹显示UV-B下BES1蛋白水平下降；B：RT-qPCR显示UV-B抑制BES1转录；C-E：低波长UV-B抑制BES1启动子激活。
讨论
1、BR激活BES1介导植物生长和UV-B胁迫耐受性之间的平衡
BR是一种重要的甾体激素，参与植物发育和各种应激反应。例如，在干旱胁迫下，BES1通过选择性自噬降解；BES1与干旱诱导的转录因子RD26相互拮抗；BES1和BZR1抑制脱落酸调控的转录因子基因的表达。先前研究表明UV-B信号通过抑制BR信号通路抑制植物生长。BR信号通路突变体bri和det2植株类黄酮含量高，抗UV-B胁迫能力增强。这些表型可能是由于BES1的双重功能，BR激活的BES1不仅促进生长，而且抑制PFG/MYB转录。此外，植物生长和体内黄酮类化合物积累之间存在平衡关系，过度积累的黄酮类化合物会抑制植物生长。BR信号通路促进BES1去磷酸化，促进其与PFG MYBs结合，表明BES1在UV-B胁迫耐受中的作用是由BRs调控的。虽然UV-B胁迫并不影响BR的含量和BES1的去磷酸化，但它通过一种未知的机制抑制BES1的转录。综上所述，BES1是调节植物生长和UV-B胁迫之间平衡的关键因素。
2、UV-B和BR对类黄酮生物合成具有重要作用
“防晒”类黄酮的积累，包括黄酮醇、花青素和原花青素（PAs）可保护植物细胞免受UV-B损害。HY5在MYB诱导中起关键作用。BES1对UV-B应激反应有直接和间接的影响。野生型与BES1-RNAi的PFG MYB表达无显著差异，而在UV-B处理下，BES1-RNAi株中PFG MYB的表达高于野生型。然而，无论是否UV-B处理，野生型和bes1过表达株的PFG MYB表达均无差异。野生型中可能已有足够的BES1蛋白抑制PFG MYB表达，因此BES1过表达的抑制并不显著。在BRZ（BR抑制剂）处理下，即使没有UV-B, bes1过表达株的PFG MYB表达也低于野生型，说明bes1对PFG MYB表达的影响是组成性的。
研究表明bri突变体在光照下生长时呈深绿色和矮化，BR突变体在UV-B调控的防御基因表达上存在缺陷，导致CHS（查尔酮合成酶）在bri1突变体中表达下调。而本研究与此结论不同的原因可能是实验中使用的植物年龄不同。本研究结果显示在5周龄幼苗中，无论是白光还是白光加UV-B条件下，bri1突变体中CHS和PFG MYB的表达均低于野生型。相比之下，在7日龄幼苗中，无论是UV-B处理还是未处理，bri1突变体中CHS和MYB12的表达均高于野生型。由此看来，发育阶段或年龄对BR调控类黄酮生物合成基因表达具有重要影响。综上所述，BES1控制生长相关基因和PFG MYB的表达，以介导植物生长和UV-B胁迫耐受性之间的平衡。窄波段UV-B光和BR介导UVR8-BES1相互作用使光和BR信号协调植物生长发育成为可能，而宽波段UV-B抑制BES1表达，诱导HY5表达，促进黄酮醇合成和UV-B胁迫耐受性（图6）。
图6 UVR8与非UVR8的UV-B响应调控模型。当植物生长无UV-B胁迫，BR信号通路激活BES1，抑制PFG MYB表达，调控类黄酮生物合成；当植物被窄波段UV-B照射时，诱导UVR8与COP1相互作用，促进HY5积累，从而启动UV-B光形态发生，包括激活PFG MYB的表达；当植物被宽波段UV-B照射时，除激活UVR8-COP1-HY5信号通路外，UV-B胁迫还以不依赖uvr8的方式抑制BES1的表达，类黄酮保护植物细胞免受UV-B胁迫。
评论
紫外线（UV-B）光是植物潜在胁迫因子，但植物如何协调生长和UV-B胁迫尚不清楚。本文报道了油菜素类固醇（BR）信号通过调控黄酮醇生物合成来抑制拟南芥和各种作物的UV-B胁迫响应，进一步证明了BES1介导植物生长和UV-B防御反应之间的平衡。BES1是参与BR信号转导的主转录因子，可抑制转录因子基因MYB11、MYB12和MYB111的表达，从而激活黄酮醇的生物合成。然而，宽波段UV-B会下调BES1的表达，从而促进黄酮醇的积累。这些结果表明，BR激活的BES1不仅能促进生长，还能抑制类黄酮的生物合成。UV-B胁迫抑制BES1的表达，使植物及时从生长转向UV-B胁迫响应。