编译：Mr.Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
铀是一种非必需元素，很容易吸收并保留在植物根部，对植物根部造成损伤，而不是转移到植物的其他部位。对铀的植物毒性机理了解甚少。在本研究中，选择毒理学模型植物蚕豆作为实验材料来研究铀的植物毒性机理。在本研究中，通过整合代谢组学，转录组学和矿物营养素代谢分析技术，研究了铀在不同浓度处理（0–25 μM）下对蚕豆的生长，代谢组，转录组和矿质营养素代谢的影响。结果表明，根和地上部分的铀积累分别达到164.34-927.90 μg/盆和0.028-0.119 μg/盆。铀主要积累在根的细胞壁上，破坏了根的微结构，抑制了根的生长发育。在矿物质营养代谢方面，铀处理（0–25 μM）导致幼苗的矿物质代谢谱发生变化。在非靶向代谢组学中总共鉴定出612种不同的代谢物，包括309种显著上调的代谢物和303种显著下调的代谢物。使用RNA-seq，在高浓度铀处理（25 μM）下鉴定出4974个差异表达基因（DEG），包括1654个显著上调的基因和3320个显著下调的基因。代谢途径分析表明，高浓度的铀导致植物中矿物营养素代谢的失衡以及植物代谢和转录组途径的改变，包括胞间连丝功能和生长素信号转导途径的改变。后一个发现可能可以解释铀对植物根系的毒性作用。
原名：A metabolomic, transcriptomic profiling, and mineral nutrient metabolism study of the phytotoxicity mechanism of uranium
译名：铀的植物毒性机理的代谢组学，转录组谱和矿物营养素代谢研究
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：9.038
发表时间：2019.10
通讯作者：罗学刚
通讯作者单位：西南科技大学
DOI号：10.1016/j.jhazmat.2019.121437
1 植物生长和铀积累
铀处理72 h后，随着铀浓度（0-25 μM）的增加，蚕豆的根部逐渐变黑（图1A）。尽管在短期内铀对蚕豆生物量的影响不显著（小于72 h），但根和地上部分的生物量却呈下降趋势（图1B）。就不同器官中的铀积累而言，当铀浓度为5-25 μM时，根中铀积累达到164.34-927.90 μg/盆，总吸收率达到46.03-55.05％（图1C）。但是，地上部分的铀积累仅为0.028-0.119 μg/盆，总吸收率小于0.01％（图1C）。这些结果表明，有毒元素铀不易转移到地上部分，而铀在根中的积累是造成根发黑的直接原因。
图1 铀在蚕豆中的积累效应及其对幼苗生长的影响。（A）幼苗生长状态。（B）铀对幼苗生物量的影响。（C）幼苗中的铀含量。不同的小写字母（a，b，c等）表示地上部分不同处理之间的显著差异（n = 3）。不同的大写字母（A，B，C等）表示根部不同处理之间存在显著差异（n = 3）。
2 铀积累对根结构的损伤
为了分析铀积累对根细胞结构的影响，对铀处理（0 μM和25 μM）的根系石蜡包埋切片进行了分析。结果表明，与对照相比，铀处理破坏了根部组织结构，并显著抑制了主根上侧根的发育（图2A1，C1）。与对照组相比，铀处理组的侧根表皮组织也被破坏（图2B1，D1）。透射电子显微镜分析的结果表明，在铀处理组中，致密的沉积物附着在根细胞壁和细胞间隙（图2C2，D2），而对照组的根细胞壁和细胞间隙则没有（图2A2，B2）。X射线能谱分析的结果证实了这些致密沉积物中存在铀（图2E，F）。结果还表明，根细胞壁和细胞间隙是铀积累的主要场所，大多数铀不会跨细胞膜转运，而是在根中积累。
图2 铀处理下铀对蚕豆根细胞结构的影响。A1-D1指植物的石蜡切片（5倍物镜），红色圆圈中的图像表示在40倍物镜下观察到的植物结构。A2-D2是指根细胞的超微结构（×1k），红色圆圈中的图像表示在TEM 4000倍观察到的植物的超微结构。E和F分别表示C2和D2中致密沉积物的EDX结果。
3 铀积累引起矿物质代谢异常
如图3所示，不同浓度的铀显著干扰了幼苗中的矿物质代谢。在大量元素方面，铀显著干扰了幼苗对P的吸收和转运，地上部分，根和整个植物中的P含量分别下降了8.08–13.33％，17–38.86％和10.75–24.74％（图3A）。铀对K，Ca和Mg的代谢具有相似的作用，所有这些都表现出相似的吸收和转运模式。根部和整株植物中K，Ca和Mg的含量增加，而地上部分中这三种元素的含量则随着铀浓度的增加而降低。因此，随着铀浓度的增加，这三种元素的转移系数逐渐减小（图3B–D）。此外，结果表明，根中高浓度的铀似乎阻碍了微量元素向地上部分的转移。在微量元素中，铀抑制根部Fe，Mn，Zn，Cu和Na的吸收（图3E–I），抑制率分别为1.43–11.20％，36.15–64.28％，2.69–9.52％，21.21–49.13％和12.14–28.35％。另外，地上部分的含量和这些微量元素的转移系数显示出先增加后减少的趋势。为了可视化铀与矿物元素之间的相互作用网络，进行了PLS-DA分析和加权网络映射。如主成分分析结果所示（图4A），根据暴露于不同的铀浓度（0-25 μM），矿物质代谢的主成分1和主成分2（PC1和PC2）清晰分离，解释了94%的数据变化。结果表明，随着铀浓度的升高，PCA图中矿物质元素的簇位置明显移位，说明铀处理过程中铀显著干扰植物的矿物质营养代谢，且干扰程度与铀浓度有关。根据权重网络图（图4B），尽管铀与P，Na和Cu表现出显著相关性，但P与其他矿物质元素的连通性最高，表明P处于矿物质代谢调控网络的枢纽位置。这些结果清楚地表明，铀暴露导致幼苗，特别是P的矿物质代谢特征发生变化，这表明P代谢异常可能是植物生长异常的主要原因之一。
图3 铀对蚕豆幼苗不同矿物质含量的影响。柱形图顶部的数字表示幼苗中矿物质元素的转移系数。*表示铀处理下的矿物质元素含量与对照组相比有显著差异（P <0.05）（n = 3）。
图4.蚕豆幼苗矿物代谢的主成分分析（A）和加权网络图（B）的得分图（PC1与PC2）。在（B）中，不同的圆形节点代表不同的矿物元素。当一种矿物元素在网络中的连接程度更高且在网络图中更为重要时，网络中矿物元素的红色圆形节点（矿物元素）会更大，并且颜色会变得更深。（B）中的数据表示铀含量与不同矿物元素含量之间的相关系数。*表示差异在0.05水平上是显著的。**差异在0.01水平上是显著的。
4 铀积累对根代谢和转录组表达产生不利影响
非靶向代谢组学（GC-MS代谢组学）鉴定出184种代谢物，其中68种差异表达（VIP > 1和P <0.05），包括26种表达上调的代谢物和42种表达下调的代谢物。这些DEM主要分类为碳水化合物（23.53％），有机酸（23.53％）和次级代谢途径（20.59％）（表1和S1）。LC-MS代谢组学共鉴定出5090种代谢物，其中有544种差异表达（VIP > 1和P <0.05），包括283个表达上调的代谢物和261个表达下调的代谢物。这些DEM主要分类为脂质（46.69％），次生代谢产物（33.27％）和有机氧（6.62％）（表1和S2）。对KEGG富集的可视化分析显示，在KEGG途径中注释的DEM（在GC-MS代谢组学分析中）主要富集在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢（ko00250）；柠檬酸循环（TCA循环）（ko00020）；碳代谢（ko01200）；乙醛酸和二羧酸代谢（ko00630）；氨基酸的生物合成（ko01230）；和丁酸甲酯代谢（ko00650）（图5）。在LC-MS代谢组学分析中，在KEGG途径中注释的DEM主要富集在类固醇生物合成（ko00100），亚油酸代谢（ko00591），α-亚麻酸代谢（ko00592），柠檬酸循环（TCA循环）（ko00020）和嘌呤代谢（ko00230）（图5）。这些发现表明，铀的积累会严重干扰植物的基本代谢途径，例如呼吸和脂质代谢，氨基酸代谢和核苷酸代谢，并且它激活植物的生理途径，从而导致非生物胁迫下次级代谢产物的积累。转录组测序结果显示，在铀诱导条件下，在根中检测到4974个DEG，包括1654个显著上调的基因和3320个显著下调的基因（图6A，B，表S3）。通过KEGG中的基因注释和途径映射对DEG进一步分类。结果表明，DEG分布在细胞过程，环境信息处理，遗传信息处理和代谢中。大多数DEG集中在代谢过程途径中（图6C）。对KEGG富集的可视化分析表明，在KEGG通路映射中注释的上调基因主要在以下途径中被富集：苯丙烷生物合成（ko00940；上调基因，n = 27），药物代谢（即细胞色素P450）（ko00982；上调基因，n = 14），细胞色素P450对异生素的代谢（ko00980；上调基因，n = 14），谷胱甘肽代谢（ko00480；上调基因，n = 17）和酪氨酸代谢（ko00350；上调的基因，n = 10）（图7）。此外，结果表明，上调的基因在氨基酸生物合成，脂质代谢和次生代谢途径中被显著富集（图7）。在KEGG途径映射中注释的下调基因主要富集在以下途径中：光合作用-天线蛋白（ko00196；下调基因，n = 34），光合作用（ko00195；下调基因，n = 40），戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转换（ko00040；下调基因，n = 27），亚油酸代谢（ko00591；下调基因，n = 13）和胞间连丝（间隙连接）（ko04540；下调基因，n = 18）（图7）。下调的基因在与细胞分裂，细胞周期和碳代谢有关的途径中被显著富集（图7）。这些结果表明，高浓度的铀对基本植物代谢途径（如碳和氮代谢）会造成严重干扰。此外，结果指出，响应非生物胁迫铀激活了植物的生理途径，例如细胞色素P450的诱导和苯丙烷类次生代谢产物的积累。
表1 铀诱导后蚕豆根部代谢物差异表达的结果
注意：DEM代表代谢物的差异表达。DEM的筛选条件为：变量投影重要性（VIP）> 1，P < 0.05。所有处理组均具有6个独立的生物学重复（n ＝ 6）。
图5 KEGG途径中DEM富集途径的可视化分析。气泡图显示了前20位的KEGG富集途径。根据每个途径的P值，KEGG富集途径从大到小排列。气泡图的X轴为富集分数。气泡大小越大，涉及的DEM越多。气泡的颜色变化为紫色，蓝色，绿色，红色。P值的富集途径越小，意义越大。
图6 蚕豆幼苗DEG的热图分析（A），差异表达基因的统计结果（B）和KEGG分类结果（C）。DEG的筛选条件为：倍数变化＞ 2且P＜ 0.05。所有处理组具有3个独立的生物学重复（n ＝ 3）。
图7 KEGG途径中DEG富集途径的可视化分析。气泡图显示了前30位的KEGG富集途径。筛选条件是不同独立基因的途径数目大于2。根据每个途径的P值，KEGG富集途径从大到小排列。气泡图的X轴为富集分数。气泡越大，涉及的差异独立基因越多。气泡的颜色变化为紫色，蓝色，绿色，红色。P值的富集途径越小，意义越大。
5 铀诱导的胞间连丝通路功能障碍
胞间连丝作为物质（例如离子，氨基酸和核苷酸）的运输，次级信号分子的运输以及植物细胞之间信息转移的通道。胞间连丝相关的结构蛋白与间隙连接蛋白同源。在植物中发现了一些类似于动物缺间隙连接蛋白的结构蛋白。在本研究中，高浓度的铀会显著抑制与胞间连丝通路相关的基因的表达，包括ras样蛋白基因，促分裂原活化蛋白激酶激酶基因，微管蛋白α链基因和微管蛋白β链基因。在铀处理下，ras样蛋白，蛋白ras-2，微管蛋白α-2链，微管蛋白β-5链和微管蛋白β-1链基因的表达水平被显著抑制了3倍以上（表2）。结果表明，胞间连丝功能异常可能会干扰植物的基础代谢过程。结合代谢组学结果表明，铀显著降低了各种游离氨基酸，核苷酸及其类似物的含量。就游离氨基酸而言，酵母氨酸，色氨酸，赖氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酰酪氨酸，丝氨酸和氨基戊酸的含量显著降低，而谷氨酸和鸟氨酸的含量在铀处理条件下增加（图8A–C）。苯基氨基腺苷，2'-O-甲基-腺苷，5'-脱氧腺苷，肌苷-5'-单磷酸，脱氧鸟苷，3-脱氧-鸟苷，二甲基-鸟苷，2'-脱氧-鸟苷和胸苷的含量也显著降低，而在铀处理条件下，腺嘌呤和FMNH2含量增加（图8D–F）。结合转录组结果显示，铀显著干扰相关无机离子转运蛋白基因的表达。如图9A和B所示，热图和载荷图显示，由于暴露于高浓度的铀（25 μM），无机离子相关基因的表达模式的第一主成分（PC1）明显分离，这解释了数据变化的79.7％。结果表明，随着铀浓度的升高，PCA图中无机离子相关基因的簇位置明显移位，这表明高浓度的铀明显干扰了无机离子相关基因的表达方式。在大量元素方面，铀积累显著改变了与根中N，P，S，K，Ca和Mn的运输和代谢有关的基因的表达方式，这可能导致这些矿质元素的代谢失衡。关于微量元素，铀明显干扰根中与Cu和Fe转运和代谢有关的基因的正常表达模式，其特征是Cu分子伴侣，Cu转运蛋白，Fe2+转运蛋白和相关酶基因的异常表达，可能导致植物中Cu和Fe代谢的异常。此外，其他微量元素，无机离子转运和无机离子代谢（例如Mn，Zn和Na）以及类金属硫蛋白基因，植物螯合肽合成酶基因，硒结合蛋白基因的基因，以及谷氨酸门控离子通道和碳酸酐酶基因的表达模式也受到干扰（图9C和表S4）。上述干扰可能导致植物中异常的无机离子转运和代谢。
表2 胞间连丝通路中DEG的鉴定。
表中的粗体表示基因表达的差异倍数大于3。**表示在0.01水平上有显著差异。
图8 在铀诱导下DEM中鉴定的氨基酸和核苷酸。A–C显示鉴定出的氨基酸有显著差异。D–F显示鉴定出的核苷酸有显著差异。所有处理组均具有6个独立的生物学重复（n ＝ 6）。*表示在0.05水平上有显著差异。**表示在0.01水平上有显著差异。
图9 在无机离子转运和蚕豆幼苗中的热图分析（A），主成分分析（B）的得分图（PC1对PC2）和DEG的分类（C）。
6 铀诱导的色氨酸代谢和生长素信号转导途径功能障碍
铀还显著干扰色氨酸代谢和植物生长素信号转导途径（图10）。统计分析的结果表明，色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径中的三种代谢产物（5-羟色胺，黄尿酸和吲哚乙酸）被显著下调，其表达水平分别降低了1.16、1.12和0.55倍。此外，在该途径中检测到27个DEG（上调，n = 8；下调，n = 19）（图10A–C）。高等植物中吲哚乙酸（IAA）的合成主要通过吲哚丙酮酸途径进行。吲哚-3-乙醛氧化酶是该途径中的关键酶。结果显示，铀显著抑制（0.87倍）编码吲哚-3-乙醛氧化酶的基因，并且导致IAA含量显著降低（0.55倍）（表3和图10C）。生长素介导的信号转导中涉及的DEG被映射到KEGG注释途径。结果表明，铀诱导的植物生长素含量降低，并且铀导致显著抑制生长素转运类蛋白基因（AUX1，下调，n = 3），生长素响应蛋白基因（AUX/IAA，上调，n = 1；下调，n = 5）和生长素响应因子基因（ARF，下调，n = 2）在信号转导途径中的表达。它还导致吲哚-3-乙酸-酰胺基合成酶GH3基因（GH3，上调，n = 1；下调，n = 1）和生长素响应蛋白SAUR基因（SAUR，上调，n ＝3；下调，n ＝ 4）表达的失衡（图10A和表3）。因此，根中的铀积累会干扰生长素信号转导途径，并最终导致对蚕豆生长的抑制。前面提到的可能是蚕豆中铀毒性的潜在机制。此外，在调节侧根发育中起重要作用的快速碱化因子（RALF）基因家族的表达被显著下调（3.16倍）。这一发现可能解释了铀诱导的蚕豆侧根发育受到的抑制。
图10 铀对色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径中代谢物和基因表达的影响。（A）显示了生长素信号传导的途径，圆圈代表代谢产物，方框代表调节基因。红色表示基因表达被上调，而绿色表示基因表达被下调。黄色表示该基因家族中既有上调基因又有下调基因。（B）显示色氨酸代谢途径和生长素信号传导途径中DEG的统计结果。（C）显示DEM在色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径中的表达。表S5中列出了相关DEG的注释信息。
表3.色氨酸代谢和生长素信号转导途径中DEG的注释。
表中的粗体表示基因表达的差异倍数大于3。DEG的筛选条件为：倍数变化＞ 2且P ＜0.05。**表示在0.01水平上有显著差异。
矿物营养素代谢可以与重金属代谢过程相互作用，并共同调节重金属的吸收，分布和转运以及生理应激响应过程。植物调节细胞中阴离子和阳离子的含量，以维持电中性环境，平衡的离子组成和代谢活性。但是，这种平衡很容易受到非生物胁迫的干扰。例如，在以前的研究中，P显著降低了拟南芥中铀的生物利用度和铀积累，从而减轻了铀对根细胞和生长的毒性作用。P还显著降低羽扇豆属植物根和茎中铀的积累，并减轻铀对根，茎和叶生长的抑制。本研究结果指出植物中P含量和铀之间存在显著的相互作用。较高的铀浓度会显著降低植物中的P含量，并抑制P相关转运蛋白基因的表达，例如无机磷酸盐转运蛋白（图3，图9）。同时，高浓度的铀处理也干扰了蚕豆的离子组学，导致矿物质营养代谢的失衡。先前的研究表明，细胞壁中高浓度的铀明显干扰植物根系对矿物元素的吸收和转运。在这项研究中，铀积累分布在细胞壁中，严重破坏了胞间连丝，胞间连丝作为游离氨基酸，核苷酸和无机离子的转运通道。铀对胞间连丝的损伤通过对矿物营养素、氨基酸和核苷酸的代谢产生不利影响，直接导致相关代谢物的失衡(图4、8和9)。铀对矿物营养素代谢和相关功能基因表达模式的影响可能解释了铀诱导的植物毒性。同时，植物对矿质元素的吸收主要通过外质体和共质体吸收途径发生，使这些元素通过根细胞的细胞间隙。作为一种不易转移的非必需元素，在本研究中铀易于吸收并保留在根中，对植物根部造成明显损伤。机制之一是高浓度的铀对参与元素转运蛋白基因具有显著的抑制作用，从而导致铀在根部封锁。铀诱导的胁迫通过辐射毒性，离子毒性，渗透胁迫和次级氧化胁迫影响植物的生长。以前的研究表明，植物通过一系列生理和分子机制适应了胁迫环境。应对胁迫的防御机制包括调节功能基因的转录，激活与胁迫相关的基因途径（例如，P450代谢途径和次级代谢途径），合成与胁迫相关的物质（例如，抗氧化酶，脯氨酸，甜菜碱，谷胱甘肽），并调节相关的代谢途径（例如，次级代谢产物，离子转运和氧化还原反应）。在本研究中，铀处理激活了生理应激相关的响应途径，例如细胞色素P450途径，苯丙烷类生物合成途径和脂质代谢途径，以及其他相关的基因表达途径。该发现表明植物响应于铀毒性而激活了防御系统。在以前对拟南芥的研究中，低浓度的铀增加了根尖的有丝分裂活性，这诱导了主根的生长并抑制了侧根的形成。然而，高浓度的铀（约30 μM）抑制了主根的生长，并诱导了侧根中的胼胝体和木质素沉积。在本研究中，高浓度的铀（25 μM）导致对蚕豆主根上侧根生长点的显著抑制和对根表皮组织细胞的明显损伤（图2）。高浓度的铀也显著抑制了与细胞有丝分裂和碳代谢途径有关的基因的表达（图7）。在代谢水平上，铀积累导致各种初级代谢产物（如氨基酸，核苷酸，多糖，脂质和维生素）的含量存在显著差异（表1和图5），表明铀诱导了这些物质的代谢失衡。后者可能是铀植物毒性的潜在机制。快速碱化因子（RALF）属于多肽生长调节剂，可与非蛋白信号分子（例如生长素，赤霉素和细胞分裂素）形成信号网络，以调节植物的生长和发育。在以前的研究中，外源添加10 nM合成的RALF可显著抑制番茄根的伸长。烟草中Na-RALF表达的下调对于主根和根毛的正常生长至关重要。拟南芥中AtRALF1或AtRALF23基因的过表达抑制了幼苗的生长。在本研究中，RALF34的表达被显著下调，这可能潜在地减轻了铀诱导的根系结构损伤和根系生长发育（图10和表3）。但是，铀会显著降低生长素的含量并诱导AUX1，AUX/IAA和ARF基因表达的显著下调。后者可能阻止了TIR1和AUX/IAA的结合，导致生长素响应蛋白的降解延迟。如先前所报道，生长素响应蛋白抑制ARF转录因子，从而导致ARF转录因子失活和其下游基因的异常表达。在本研究中，GH3和SAUR表达的失衡可能影响了植物的生长（图10和表3）。因此，铀诱导的蚕豆根中生长素信号转导途径的损伤可能是铀植物毒性的潜在机制。在本研究中，通过整合代谢组学，转录组谱和矿物营养素代谢分析技术，分析了植物中铀植物毒性的潜在机制。在幼苗实验中，高浓度的铀导致根黑化和蚕豆死亡。就铀的亚细胞分布而言，它主要分布在根的细胞壁上，破坏了根的微结构并抑制了根的生长和发育。关于铀的毒理学机理，在高浓度时它导致矿物质营养素代谢的失衡以及植物正常代谢和转录组的变化。值得注意的是，高浓度的铀对胞间连丝的功能和生长素信号转导途径有不利影响。研究结果指出了铀植物毒性的潜在机制。铀是一种非必须矿物元素，然而其可以通过多种方式对植物造成胁迫，引起植物一系列的生理和分子响应。在这一研究中，作者通过多种分析手段以揭示铀植物毒性作用的可能机制。研究发现，铀只是沉积在植物的根部而不向地上组织转移，并破坏了植物根部细胞结构，抑制根部生长发育。且发现高浓度铀处理可以造成植物矿物营养素的代谢失衡，而P含量和铀之间存在显著的相互作用。此外，该研究揭示了铀植物毒性可能的潜在机制，为将来进一步研究铀的植物毒性作用提供参考。
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