科研 | Circulation: 单细胞RNA测序分析自身免疫性心肌炎的免疫网络（国人佳作）
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Single-Cell RNA Sequencing to Dissect the Immunological Network of Autoimmune Myocarditis
译名：单细胞RNA测序，解剖免疫网络__自身免疫性心肌炎
期刊：Circulation
影响因子：23.054
发表时间：2020年5月20日
作者：宋江平
单位：阜外心血管病国家重点实验室
DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.119.043545
背景介绍
心肌炎是心脏中一种复杂的炎症反应，其临床和组织学研究揭示这是免疫反应异常的结果。心肌炎的病理过程分为3个阶段：急性炎症反应、亚急性炎症反应和慢性心肌病。尽管对心肌炎机制的研究已经取得一些进展，但是心脏细胞渗透的复杂性缺乏认知，特别是在单细胞水平上研究这些群体的方法缺乏。另外对心肌炎症反应的特定免疫细胞群体尚不清楚，这也限制了治疗药物的发展。近期免疫调节疗法，例如IL-1β抑制剂和astragaloside IV被视为心肌炎治疗新的靶向。但是，利用抗炎症药物或者免疫抑制剂对急性心肌炎的治疗仍然失败，这些抗原并未表现出阳性效果甚至副作用。这些失败都归咎于对治疗和从急性炎症时期到自体免疫导致的心肌病时期心肌免疫环境改变之间的认知太少。
单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）能够在单细胞的水平绘制特异的细胞群体。尽管传统的bulk RNA测序的方法处理数百万个细胞得到平均的差异，scRNA-seq能够揭示单个细胞类型的改变。显著的是，scRNA-seq已经广泛的应用于不同领域免疫性的描述。通过分析从EAM小鼠不同时期分离得到的心肌免疫细胞进行scRNA-seq，研究者揭示了EAM模型中变化的免疫活性。研究者首先在单细胞水平对EAM进化过程中的免疫细胞进行图谱绘制，然而得到免疫细胞的群体，例如与免疫反应相关的巨噬细胞和Th17细胞。Hif1a被确定是免疫相关细胞集簇中关键的转录因子，其抑制剂PX-478能够减弱不同时期EAM的免疫反应。最终研究者发现HIF1A在自体免疫心肌患者中的表达高于DCM和健康对照组。总而言之，上述结论都提示Hif1a+的免疫细胞与EAM模型中炎症反应相关，提示Hif1a可作为临床治疗自体免疫心肌病的潜在靶向。
结果
scRNA-seq与不同时间点心肌炎的细胞类型
研究者构建了不同时期的EAM模型，包括正常对照时期（day 0）、急性炎症时期（day 14）、亚急性炎症反应时期(day 21)以及心肌病时期(day 60)。左心室舒张末期内径和左心室终末期容积在心肌病时期是最大的（图1A、1B）而左心室射出分率(LVEF)和分数缩短(FS)是的最低的(LVEF: day 0, 73.00 ± 7.61%; day14, 66.85 ± 7.10%; day 21, 62.17 ± 10.63%; day 60, 58.08 ± 9.10%, p=0.0019. FS: day 0, 41.39 ± 6.41%; day 14, 36.47 ± 5.24%; day 21, 33.08 ± 8.16; and day 60, 30.36 ± 5.98，p=0.0020)（图1C、1D）。在心脏组织中炎症细胞的渗透在day14是最严重的，并且在day21降低，持续降低至day60。
图1 EAM模型中分离得到的34,665个单细胞分析图谱
巨噬细胞构成了每个时期主要的免疫细胞群体(range:61.06-72.88%, average: 65.03%)，B细胞在day0，嗜中性白细胞在day14和21，T细胞在day60（图IV）。免疫时期（大约14和21）前五的免疫细胞集簇是巨噬细胞集簇2(99.79%)、巨噬细胞集簇3(96.61%)、嗜中性白细胞集簇3(95.74%)、T细胞集簇3(89.67%)和T细胞集簇2（85.92%）（图1D、表II）。总之这些结果都表明心脏中免疫系统内的细胞成分在EAM进程中是功能改变的。研究者总结了在细胞集簇中的功能基因进一步探究某一细胞集簇的功能（表IV）。
心肌炎相关巨噬细胞以Hif1a的表达为特征并且不同的巨噬细胞集簇对不同的EAM过程发挥作用
研究者检测到了22,348个最大的细胞群体巨噬细胞，分为你9个集簇，在EAM的不同时期发挥作用（图2A）。在巨噬细胞集簇中观察到巨噬细胞的极化现象，一个细胞集簇能够表达M1和M2标记物基因（图2B）。研究者进一步确定了每个集簇中的标记基因，例如集簇2中的Cxcl9，集簇3中的Ccl8，集簇6中的Vcan以及集簇8中的Vsig4（图2C、表1）。集簇2是急性炎症时期主要的巨噬细胞集簇，峰值在day14，与炎症反应相关（图2D、图IIE）。Nos2、Arg1、Ass1在集簇2中差异表达（图2B、图VA）并且集簇2的功能参与NO的生物合成、吞噬体和抗原过程以及通过MHC Class I的内源性肽抗原呈递 (图VB)。总之这些数据提示巨噬细胞集簇2表达Ass1和其他NO生物合成相关的基因产生NO，促进EAM急性炎症时期抗原的加工以及通过吞噬体的内源性肽抗原呈递。研究者发现Ccl8在集簇3中差异表达（图2C），集簇3是亚急性炎症时期的标志巨噬细胞群体，峰值在day21（图2D）。集簇3的功能包括抗原加工以及通过MHC class II的外源性肽抗原呈递、细胞趋化性以及单核细胞的转移（图VB）。Tnf、Il-10、Vsig4在集簇8中差异表达，在day14时比例最低，然而逐步增加（图2B-2D）。与此结果一致，集簇8在防御反应中发挥正向调节作用（图VB）。集簇7包含M2偏振的巨噬细胞能够表达Clec10a并且Tnip3差异表达（图2B、图VA）。集簇7在day60出现峰值，集簇7在心肌病时期更易通过应答IL-1抑制炎症反应，负调控免疫系统、伤口愈合等免疫反应（图VB）。总之，这些结果都提示集簇7和8能够通过与Il-10和Tnip3协同作用减弱炎症反应，促进心肌时期伤口愈合。集簇6是EAM产生之后的一个稳定的巨噬细胞集簇，其显著特征使Plac8和Ly6c2的表达（图2D、图VA）。此外，集簇2/3/9表达Ly6i或者Ly6c，提示这些巨噬细胞来源于单核细胞（图2C、图VA）。
图2 巨噬细胞图谱
急性炎症反应的巨噬细胞应答IFN-γ，参与活性氧类的新陈代谢（图2E）。研究者比较了炎症和心肌时期的巨噬细胞发现，炎症时期的巨噬细胞在抗原加工、呈递以及应答IFN-γ中发挥作用，而心肌病时期的巨噬细胞在MAPK级联反应、TNF信号通路以及NF-κB通路中发挥作用（图2E）。
研究者利用单细胞调控网络推论以及聚类分析（SCENIC）评估了不同细胞集簇中导致基因表达差异的转录因子。SCENIC确定了Bhlhe40、Nfil3、Mtf1、Esrra、Rnux3、Hif1a作为在巨噬细胞集簇2中基因表达差异的关键TFs，以及Crem、Irf7、Bach2、Hif1a、Rxra作为巨噬细胞集簇3中基因表达差异的关键TFs（图2F、2G）。与自体免疫以及2型免疫相关的一些TFs：Ezh2、Bhlhe40、Stat5a确定是巨噬细胞集簇7的关键基因。同时确定了与巨噬细胞表型相关的TFs：Irf5和Srebf2。
嗜中性白细胞释放I1-1参与EAM过程
研究者检测了4,299个嗜中性白细胞（超过炎症时期的86%）分为3个集簇（图3A）。由于Il-1在心肌炎的病理过程中发挥关键的作用，研究者探究了嗜中性粒细胞的表达。如图3B，在集簇1和3中Il-1a的表达升高，而Il-1b在三个集簇中表达很高。Il-17a在嗜中性粒细胞中并不表达，但是Mmp8在三个嗜中性粒细胞中都表达（图3B）。在所有的嗜中性粒细胞中，研究者确定了Osal2和Il18bp是集簇1中的特异基因，Ngp和Prok2是集簇2中的特异基因（图3C）。一些CXC的驱动因子(Cxcl3、Cxcl2、Cxcl10)和一些Gbps (Gbp2、Gbp2b、Gbp3、Gbp4、Gbp5、Gbp7、Gbp9)在集簇1中表达（图VIA）。集簇1在day14构成了嗜中性粒细胞的主要成分，并且这一集簇能够产生细胞因子如IL-6和TNF（图VIB），集簇1的功能包括调节防御反应、嗜中性粒细胞的去颗粒作用以及炎症反应（图VIB）。总之，这些结果表明嗜中性粒细胞集簇1（Il1a+嗜中性粒细胞）是早期EAM炎症时期促炎症的集簇，集簇2是心肌疾病主要的嗜中性粒细胞群体（超过80%）并且高表达Mmp8（图3B）。集簇2正向调节MAPK级联反应以及肌动蛋白细胞骨架组织，这些通路对于心肌到DCM或者纤维化过程发挥作用（图VIB）。总之，这些结果表明嗜中性粒细胞集簇2 (Ngp+ Mmp8+嗜中性粒细胞)是参与EAM心肌时期的主要集簇。集簇3在基因表达方面与集簇1相似，并且这三个集簇表达S100a8和S100a9（图3C）。
图3 嗜中性粒细胞图谱
与day0分离得到的嗜中性粒细胞，day14可能对嗜中性粒细胞的去颗粒作用、抗原加工、内源性肽抗原呈递以及Toll样受体级联相关，Toll样受体级联与IL-1β的产生相关（图3E）。此外，day60分离得到的嗜中性粒细胞对肌动蛋白丝的加工、氧化应激的回应、自身凋亡信号通路的调节以及结合的正调控发挥重要作用（图3E）。SCENIC揭示了在促炎症的嗜中性粒细胞集簇1中受Irf1、Irf2、Irf5、Irf7、Nfkb1、Nfkb2、Esrra、Bhlhe40、Maff、Hivep1调控的基因是上调的。显著的是，Hif1a和Irf5直接活化Bhlhe40的表达并且在急性炎症伴随嗜中性粒细胞流中发挥功能（图3F、3G）。此外，Ets1、Klf13、Rara、Max、Klf5、Cepbe、Srebf2、Fosl1、Snail1、Nfe2在促纤维嗜中性粒细胞集簇2中是活化的。有报道称Klf5对肾纤维化发挥作用（图3F、3G）。
Il-17a+ T细胞在动态的EAM炎症环境中发挥重要作用
3,805个T细胞划分为5个集簇（图4A）。辅助型T细胞Th1和Th细胞因子在任何一个集簇中都不表达，但是Th17细胞因子在集簇2和4中的表达水平较高（图4B）。集簇1中Lef1和Ms4a4b正相关且Cd4和Cd8a的表达水平低。因此，集簇1可能代表细胞毒性的T细胞，在正常心脏中最大的T细胞群体（图4B-4D）。Tnfsf8和Cxcr6是集簇2的标记基因，同样表达Cd4、Il17a、Rora、Tnfsf11（图4B、图VIIA），集簇2的功能包括T细胞活化、Th17细胞分化、Th17典型的免疫反应以及Th17细胞谱系命运（图VIIB）。基于上述结果，细胞集簇由Th17细胞组成。在所有免疫细胞中Th17细胞的比例峰图出现在day14，并且它们变化的趋势与四个时期免疫细胞的比例一致（图4D、图IIE）。在day14大约59%的T细胞是Th17细胞，因此Th17细胞能够在EAM中起始炎症反应（图4D）。集簇3的典型特征是Cd4、Foxp3、Ctla4的表达，并且参与免疫系统的负调控（图4B、4C、VIIB），这一集簇代表调节型T细胞（Treg细胞）。Treg细胞是day21主要的细胞集簇，提示其释放如IL-2/3/5/7/9/15/20的细胞因子，调节EAM亚急性的免疫反应（图4D、VIIB）。T细胞集簇4的特征是Il23r、Il-17a、Tcg-v2以及其他T细胞受体基因的表达，因此代表γδT细胞（图4C、VIIA）。依据基因富集分析发现，T细胞集簇5同样定义γδ T细胞。T细胞集簇4表达Il-17a(Il-17a+ γδ T细胞)，然而T细胞集簇5并不表达。T细胞集簇4(Il-17a+ γδ T细胞)是day60主要的细胞类型，这一集簇应答于激素刺激并且参与适应性免疫翻译以及IL-6的分泌（图VIIB）。因此T细胞集簇4（Il-17a+ γδ T细胞）可能通过释放IL-17A、IL-6在心肌炎向心肌症转变过程发挥作用。T细胞受体（TCR）测序数据也表明TCR克隆主要在day21集簇2（Th17细胞）中检测到（图4E）。
图4 EAM动态过程中的T细胞集簇
此外，day14分离得到的T细胞参与氧化磷酸化、T细胞活化、IFN-γ应答、Th17细胞分化以及适应性免疫反应。在day21基于基因特征的信号通路分析也发现这些细胞参与氧化磷酸化、T细胞活化、白细胞活化的负调控以及细胞因子介导的信号通路。T细胞富集分析在day60最大，说明了这些细胞参与了炎症反应。细胞对激素应答以及IL-17信号通路中的炎症反应、白血球分化/集合、IL-1应答以及伤口愈合（图4F）。
SCENIC提示受Th17细胞特异的TFs (Hif1a、Rora、Nfkb1)以及受Xbp1调节的基因在集簇2中是上调的（图4G、4H）。此外，受Stat1、Foxp3、Runx2调控的基因在集簇3中是上调的。受Rara、Atf6、Fosb、Rora.1以及Rarg调控的凋亡基因在集簇4中是上调的。
B细胞在EAM抗原呈递与抗体生成中发挥作用
研究者检测了1,459个B细胞构成了2个集簇（图5A）。B细胞集簇2包含最大数目的UMIs（21.5k UMIs），然而B细胞集簇1包含最少数目的UMIs(8.8k UMIs)，这一结果提示集簇2可能更加活化而集簇1更加沉默。B细胞集簇1表达较高水平的Ighd，而B细胞集簇2表达较高水平的Igkc、glc1、Iglc2、Iglc3、Ighj3（图5B）。B细胞集簇1的特征是Ms4a1 (Cd20)和Cd19的表达（图5C）。集簇1是不同EAM时期B细胞的主要群体（图5D）。此外，B细胞受体（BCR）克隆在EAM过程中检测到并且主要存在于day60的集簇1中（图5E）。集簇2中Jchain和Eaf2特异性表达（图5C）。在所有的B细胞群体中，集簇2在EAM过程中增多（图5D）。
图5 B细胞集簇
研究者确定了在不同EAM时期B细胞的功能特征。在day14时B细胞在应答IFN-β、抗原加工与呈递、受体结合的正调控中发挥作用。在day21时B细胞在髓系白细胞迁移、炎症反应、细胞因子生成以及淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节中发挥作用。在day60时B细胞在白细胞趋化作用、白细胞分化和免疫应答负调控以及IL-4的细胞反应中发挥作用（图5F）。
SCENIC发现受Elk3、Max、Irf2、Ikzf1、Spib、Pax5、Sox5调控的基因在B细胞集簇1中上调（图5G、5H）。重要的是，Irf2是MHC I抗原呈递的转录激活因子。上述结果表明集簇1（未成熟的B细胞）参与抗原的加工和呈递。受胞浆特异的TFs(Prdm1、Atf6、Xbp1、Creb3)调控的基因在集簇2中是上调的（图5G、5H）。因此B细胞集簇2能够产生抗体有利于EAM的自体免疫。
在EAM过程中的DCs
共计1,077个DCs被检测并分为3个集簇(图6A)，并且不同的集簇表达不同的标记基因（图6B和表1）。DC集簇1 (Cst3+Sept3+ DCs)是所有EAM时期主要的DC群体，在炎症时期DC集簇2(Ccr9+Klk1+ DCs)和3(Il12b+Cacnb3+ DCs)升高。有趣的是DC集簇3在正常心脏免疫细胞群体的水平较低（少于1‰），随后在炎症反应发生的过程中升高，在EAM过程中降低（图6C）。DC集簇3参与抗原的加工和呈递、岁细胞分化以及TNF等细胞因子的生成（图VIII）。
在炎症时期DCs的信号通路，包括抗原的加工和呈递、适应性免疫系统、细胞因子生成、溶酶体、异体防御应答、活性氧类的新陈代谢以及IFN-γ应答等。此外在day60DCs信号通路包括MAPK激酶活化的调节、T细胞活化的正调节、细胞增殖的负调控以及细胞死亡的正调控（图6D）。
图6 DC细胞集簇
SCENIC发现受Runx1和Irf5调控的基因在DC集簇1中上调。浆细胞样的DC（pDCs）特异的TFs例如Tcf4和Runx2在集簇2中更加活化，因此DC集簇2可能包含pDCs。此外受Ehf、Nfkb1、Stat1、Rel、Nfkb2、Stat4调控的基因在DC集簇3中高表达（图6E、6F）。在DC集簇3中Rel的表达促进Il-23的表达从而调节Th17应答。综上，这些结果提示DC集簇3可能通过活化NF-κB信号通路调节Th17应答参与EAM的炎症反应。
在EAM过程中其他小的细胞集簇
在EAM过程中除了检测到的大的免疫细胞群体，1,677个其他细胞类型划分为4个集簇，包括284个CMs、123个Endos、291个ILCs以及979个NK细胞（图1D、IXA）。此外，不同的集簇具有不同的标记物表达特征（图IXB）。NK细胞是参与EAM病理过程中IFN-γ的唯一来源（图IXB）。NK细胞的比例在day14上升但是在day21最低（图IXC），NK细胞在适应性免疫应答以及NK细胞调节的细胞毒性中发挥着作用（图IXD）。
免疫细胞亚群与EAM时期的相关性提示Hif1a参与EAM的炎症反应
研究者分析了26个集簇中炎症基因的表达和比例，以确定在EAM中与炎症相关的集簇（图7A）。一些集簇如巨噬细胞集簇2和Th17细胞，在day14高表达炎症基因，与EAM过程中整个免疫细胞的比例一致（图2D、4D、7A）。基于SCENIC，Hif1a同样在巨噬细胞集簇2和Th17细胞中表达，同时在不同细胞集簇中差异表达（图7B）。Hif1a的表达水平与细胞集簇炎症值相关(Pearson’s r=0.69, p=0.001; 图7C)。在分析的所有时期，Hif1a+细胞在day14比例最高（图7D），在不同集簇Hif1a+细胞的比例在day14显著不同，T细胞和巨噬细胞是表达Hif1a的两大细胞群体(p<0.0001,图7D)。同样，Hif1a在day14表达水平最高，随后day21、day60和day0（图7E）。上述结果提示Hif1a可能活化与急性EAM时期相关的免疫细胞类型（巨噬细胞集簇2和Th17细胞）。
图7 时期特异性细胞集簇以及Hif1a抑制剂对EAM的效果
研究者将Hif1a确定为EAM炎症反应的关键TF，并且提出假说利用PX-478等药物抑制Hif1a能够抑制EAM的炎症反应。因此，研究者构建了另一个EAM模型（n=50只小鼠）探究了EAM不同时期PX-478的治疗效果（图7F）。这些EAM小鼠被分组（day14、day21和day60）并且PX-478被注入EAM小鼠中。惊奇的是，PX-478腹腔注射到EAM小鼠中能够减弱淋巴细胞在心脏的聚集并且在day14减轻炎症反应（图7G-7I）。然而，在PX-478处理后心肌功能或者血管重塑并无显著差异。Hif1a的表达受PX-478抑制。Hif1a在巨噬细胞和T细胞中表达，PX-478在day14降低了T细胞和巨噬细胞的渗透（图7D）。此外，在其他时期PX-478处理的敏感动物，包括day21和60，发现炎症反应显著降低（图7I、XII）。总之上述结果提示Hif1a对EAM中炎症反应发挥作用，其抑制剂PX-478能够抑制不同时期的炎症。
考虑到Hif1a在不同EAM时期的炎症作用。研究者猜想是否靶向该TF能够在临床上改善心肌炎。在人类心脏样本中的观察强调了该问题的潜在临床意义。依据2013 ESC Task Force，研究者收集了急性自体免疫心肌炎(n=5)和经历Htx的慢性心力衰竭患者(DCM, n=5)的心脏样本，与健康的对照比较(n=5)。所有的样本都筛选了病毒基因组作为阴性对照。人口统计和临床的数据在表VI中。包括广泛的炎症细胞渗透和组织结构损伤的炎症反应在自体免疫的心肌炎患者中被观察到（图7J）。研究者发现与DCM和对照相比，HIF1a+的数量在自体免疫心肌炎患者中显著升高(4,106.0 ± 423.6 vs. 605.6 ± 213.7 cells per mm2, p<0.0001。4,106.0 ± 423.6 vs. 821.6 ± 223.0 cells per mm2, p<0.0001图7K)。最终，一些T细胞和巨噬细胞以及一些小的心肌细胞HIF1A表达（图7L）。上述结果都表明HIF1A与自体免疫心肌炎患者的临床相关性，可作为自体免疫心肌炎治疗的新靶向。
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