科研 | 斯坦福大学医学院：伤口在体内抑制肿瘤生长
编译：思越，编辑：Tracy、江舜尧。
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肿瘤和伤口的共性逐渐被人们关注。肿瘤被认为是没有愈合的伤口，因为其在肿瘤基质生成和伤口愈合的过程中存在惊人的相似性，这两个过程都涉及血管高渗透性和炎症细胞相关基质生成。已经有大量的研究围绕着两者在炎症、血管生成、基质生成以及基因表达的相似性，但是对于两者在体内之间存在的交互作用研究较少。本文作者通过异种移植肿瘤和全厚度切除伤口模型探究体内肿瘤和伤口的相互作用，存在位置依赖关系，并通过蛋白质组学揭示了肿瘤和伤口之间的蛋白差异。
论文ID
实验设计
实验结果
1.溃疡和伤口抑制肿瘤生长
皮肤肿瘤和血管瘤的临床研究显示，溃疡与减缓肿瘤生长有关。以前人们认为，这是因为当肿瘤生长过快时，血管生成超过了肿瘤存活所必需的条件而导致，因此肿瘤的坏死通常集中发生，并且临近皮肤表面的肿瘤会发生溃疡。我们使用用人头颈部鳞状细胞癌异种移植模型进行研究，该肿瘤发生溃疡相对较早，并且具有较低的转移率（图1A），图中的生长曲线标记了发生溃疡的点（图1B）。相比于溃疡发生前，发生后肿瘤生长率明显降低（图1C）。此外我们假设，在异种移植肿瘤上产生伤口也会减缓其生长（图1D），当在异种移植肿瘤上产生全厚度切除伤口时，在产生伤口后的八天，显著抑制肿瘤生长（图1E），此外，该伤口没有产生愈合，这与之前的研究与胶质瘤发现的皮内伤口愈合延迟现象一致。这些结果表明，全厚度切除伤口可以抑制肿瘤生长。
图1 溃疡和伤口抑制肿瘤生长
（A）在我们的体内异种移植瘤模型中显示肿瘤自然进展(棕色)伴溃疡(红色)的示意图。（B）以箭头所示为溃疡点的肿瘤生长曲线代表图。蓝线表示溃疡形成前肿瘤生长的斜率。红线表示溃疡后肿瘤生长的坡度。条形图表示溃疡发生前后肿瘤生长曲线的斜率(*P< 0.05, n = 5)。(D)实验模型示意图（E）肿瘤伤口生长曲线(棕色=肿瘤;红色=伤口)。(E)肿瘤上方无或无全层切除创面的肿瘤生长曲线(*P< 0.05, n = 10)。
2.伤口对肿瘤生长的剂量依赖性抑制作用
上述数据支持伤口对肿瘤的抑制作用，为了进一步探究这种作用，我们将全厚切除伤口放置在异种移植肿瘤附近。小鼠伤口主要是由于腱鞘皮下的横纹肌收缩所致，夹板的全层切除伤口可通过肉芽和再上皮化使小鼠伤口愈合，使伤口修复过程在时间上变得人性化。当肿瘤附近放置单个伤口时，抑制了肿瘤生长；当邻近区域放置两个伤口时，增加了对肿瘤的抑制作用，暗示可能存在剂量关系。此外，我们在先前伤口的基础上再放置一个新的伤口时，抑制作用仍然存在；但是，当伤口被放置三倍距离远时，肿瘤大小没有显著性差异，且伤口单独存在和存在于肿瘤旁对愈合率没有影响。这些数据表明，伤口对肿瘤的抑制作用存在剂量依赖关系，并与持续性损伤以及距离远近有关（图2AB）。
图2 临近伤口抑制肿瘤生长
（A）肿瘤和伤口竞争模型图1.仅肿瘤(蓝色)，2.肿瘤1处伤口(红色)，3.肿瘤2处伤口(绿色)，4.肿瘤与持续性损伤(紫色)，5.肿瘤与远处伤口(橙色)。（B）肿瘤生长曲线1.仅肿瘤(蓝色)，2.肿瘤伤口(红色)，3.肿瘤伤口2处(绿色)，4.肿瘤连续创面(紫色),5.肿瘤远处伤口(橙色)(n= 10)。
3.缺血性皮瓣抑制肿瘤生长
我们接着探究了异种移植肿瘤附近缺血性皮瓣的抑制效果。皮瓣常用于整形手术，以填补软组织缺陷，并已显示沿皮瓣的长度方向具有局部缺血梯度。具有三侧全皮厚度的半岛皮瓣是一种常见的实验性小鼠模型，通过皮瓣下方放置硅胶片以形成肿瘤旁缺血环境（图3A）。结果发现，缺血性皮瓣的放置抑制了肿瘤生长，虽然中远皮瓣发生了坏死，但是根据我们的研究发现，这些坏死可能不会影响肿瘤的生长（图3B）。这些结果表明，抑制作用与缺血相关，并存在血管生成竞争。
图3 缺血性皮瓣抑制肿瘤生长（A）模型示意图；（B）肿瘤生长曲线
4.伤口优先于肿瘤招募循环细胞
为了进一步探究体内肿瘤和伤口的竞争，我们使用异种共生模型探究循环细胞的招募情况（图4A）。我们使用NSG和NSG-GFP小鼠构建免疫缺陷异种共生模型，并通过GFP细胞的外周血确定交叉循环状态（图4B），肿瘤异种移植物和夹板全层切除创面在NSG的背侧形成(图4A，左下)。通过流式细胞分选我们发现伤口对循环细胞的招募显著增加（图4C），并招募了更多的循环祖细胞（图4D),且这些祖细胞分类为造血细胞和内皮细胞(图4E、F）。虽然该模型具有局限性，但这些数据表明，伤口愈合相比于肿瘤具有优先招募循环细胞的能力。上述结果只与自我识别的损伤模式和固有的招募模式有关，此外，这些循环细胞的招募方式和作用仍然未知，需要进一步研究。
5.肿瘤抑制作用独立于免疫反应
最近的研究发现了系统免疫反应在距离肿瘤较远的部位对肿瘤生长的作用，基于此，上述模型中免疫反应的减弱可能在我们的发现中发挥作用。我们在免疫恢复的小鼠模型中再次重复试验。我们使用小鼠4T1乳腺癌和BALB/cJ小鼠的全血移植模型。当全厚切除伤口放置在肿瘤外皮附近时，在产生伤口后的八天，显著抑制肿瘤生长（图5A），说明伤口对肿瘤的抑制与免疫反应无关。考虑到肿瘤组织的异质性，我们使用反相蛋白微阵列（RPPA）对肿瘤和伤口的功能蛋白进行探究，从肿瘤和伤口的232个差异表达蛋白中筛选出100个（图5B）。虽然尚未对这100种蛋白质进行进一步分析，但这些蛋白质可能会揭示出现象背后的确切机制。
图5 免疫恢复模型中伤口抑制肿瘤生长
（A）肿瘤生长曲线，分别表示单纯肿瘤和肿瘤附近存在伤口时肿瘤的生长情况（B）创伤后第10天采集的肿瘤和伤口样本，进行反向相蛋白阵列（RPPA）鉴定出的差异表达基因
讨论
肿瘤和伤口的相似性研究已经进行了几十年，但是，两者在体内的直接相互作用还没有被研究。Dvorak将肿瘤描述为无法愈合的伤口，这是因为肿瘤像伤口一样，会获得源自于血浆蛋白的纤维素基质，但是在伤口中，这些纤维蛋白基质会消退，而在肿瘤中持续生成，纤维蛋白基质得以维持，为免疫逃逸提供了条件。
近年来，我们对肿瘤和伤口之间的相似性的认知不断明确。肿瘤和愈合伤口都利用了许多共同的促生长因素以保持自身发育，包括转化生长因子-b，成纤维细胞生长因子-2，血小板衍生生长因子等。DNA微阵列分析暴露于血清中（这是一种成纤维细胞是伤口愈合的模型），允许发现“核心血清反应”，我们由此发现了一组被成纤维细胞调节的核心血清反应基因，与细胞复制、细胞运动和细胞外基质重塑有关。进一步的实验表明，一些肿瘤也会表现出相同的核心血清反应。在乳腺癌患者中，肿瘤具有核心血清反应的患者，更有可能向转移和死亡进展，暗示这些核心血清反应可能赋予肿瘤攻击性，此外，伤口的愈合依赖于血管生成，当愈合完成时血管适当收缩。肿瘤受益于异常的血管生成，这种异常的血管生成并不能以同样的方式自我调节，但是肿瘤血管生成是由许多在伤口中使用的相同的生长因子促进的，如VEGF、成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子。
在这项研究中，我们试图研究肿瘤溃疡是否与肿瘤生长的减慢有关。肿瘤溃疡的发生，多数是肿瘤进展迅速而肿瘤供血过多导致的，肿瘤生长超过其血液供应，导致溃疡。通过比较肿瘤溃疡前后的生长，我们发现溃疡后肿瘤生长变慢，但该现象背后的生理意义仍需研究。接着，我们将伤口直接放在异种移植肿瘤上，同样发现肿瘤生长受到抑制，并且放置在肿瘤上的伤口无法愈合，这与之前有关脑胶质瘤附近皮肤切口的研究一致。
此外，我们构建了一个异体肿瘤小鼠模型，并在临近区域构建不同位置和数量的伤口。我们的研究发现，全厚度切除伤口可以抑制肿瘤在体内的生长，并具有剂量依赖性，当具有两个伤口或者出现新的伤口时，会加强对肿瘤生长的抑制。这种效果是剂量依赖性的，两个伤口的放置增强了肿瘤抑制。我们还发现当伤口远离肿瘤时，对肿瘤生长的抑制作用被解除，说明这种抑制作用不是由于全身因素引起的，此外，当肿瘤附近存在缺血性皮瓣时，同样抑制了肿瘤生长，暗示缺血性皮瓣优先竞争血液供应。
伤口愈合是一个损伤后修复高度复杂的过程，因此，该过程比肿瘤进展更先一步也不足为奇。我们的研究发现，伤口会先于肿瘤招募循环细胞。该现象背后的机制以及与临床现象的关联，值得进一步探索。最近的一项研究表明，手术后的伤口愈合反应，触发了远处肿瘤的生长和转移，这表明，其他研究已经提出了一种系统反应，从而进一步复杂化。总之，肿瘤与伤口之间相互作用的进一步研究，有望为伤口愈合和癌症生物学提供线索。