生物制药中的分子生物学之-慢病毒载体的进化和应用
慢病毒载体的进化
慢病毒属（lentivirus）在分类上属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病，因此被称为慢病毒。慢病毒载体是以慢病毒的基因组为基础，然后去除了多个和病毒活性相关的序列结构，使其具备生物学安全性，这个基因组架构中含有表达结构并可容纳较大外源基因片段，并将之制备成载体。
慢病毒载体来源于多个物种, 如人类免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)、2 型(HIV-2), 猴免疫缺陷病毒(S IV), 马传染性贫血病毒(EIAV), 猪免疫缺陷病毒(FIV), 公山羊关节炎脑炎病毒(CEAV), 牛免疫缺陷病毒(BIV)等。其中以HIV-1为代表，对其研究最广泛最深入。
图1 野生型HIV-1的基因结构
HIV-1为双链RNA病毒，其基因组结构（图一）类似于其它的反转录病毒。根据编码的蛋白重要性不同可将9个基因分为以下三类：
a. 编码三种主要病毒结构蛋白的基因：gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白（p7）、内膜蛋白（p17）和衣壳蛋白（p24）；pol基因编码病毒复制相关的酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。
b. 编码两个调节蛋白的基因：tat、rev。rev主要参与蛋白调节的表达水平，tat参与蛋白转录的控制，与病毒的长末端重复序列（long terminalrepeats,LTRS）结合后促进病毒的所有基因的转录。
c. 编码四个辅助蛋白的基因：vif、vpr、vpu、nef，帮助病毒包装完成。
除此以外，HIV-1的基因组结构中还有病毒复制和包装等所需要的信号序列结构。
为了提高载体的生物安全性，HIV-1型慢病毒载体系统经历了以下四个阶段：
第一阶段是两质粒系统，以HIV-1为骨架构建起来的反转录病毒载体，去除了HIV基因组中的的反式作用蛋白基因序列，然后包装上含有目标基因的重组载体和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。但是这种复制缺陷型的载体系统产生病毒的滴度很低，而且只能感染CD4+细胞，并且在转染的过程中载体DNA和包装的蛋白DNA很可能会重组，导致产生活性HIV病毒的可能性，具有很大的风险。
第二阶段是三质粒系统，具体是将HIV-1基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分别克隆到三个独立的质粒中，第一个是含有CMV启动子的包装质粒，控制除env的所有病毒结构基因的表达；第二个是含有表达水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因序列的包膜质粒，这个基因用于代替原病毒中的env基因，这个基因的产物可以提高病毒的宿主范围；第三个就是病毒载体质粒，主要用于携带外源目的基因。但是这个三质粒系统因为保留了HIV-1的附属基因，导致出现具有活性病毒的可能性较大，具有一定的风险。
第三阶段是在三质粒系统中去除了HIV病毒所有辅助基因序列，将HIV中原有的9个基因只保留了3个（gag、pol、rev）于慢病毒载体中，这样很大程度的降低了重组的可能性，极大的提高了安全系数。
第四阶段是四质粒系统，目前被广泛应用的慢病毒载体系统，这个系统是在三质粒系统的基础上将env基因单独放在一个表达质粒上，而且还去除了tat基因，这样就形成了四质粒系统。该体系大大的提高了使用安全性，而且该系统中还含有可诱导性基因，使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能，并且继续保留了自身失活的优势，为探索基因的功能提供了有利的工具。
慢病毒载体的应用
慢病毒载体由于其自身诸多优势，近些年来得到了越来越多的认可及应用。如联合RNA干扰（RNA interference,RNAi）进行实验研究、基因治疗以及细胞和动物模型建立等领域。
在癌症治疗方面：Gerolami等人将带有HSV-TK/GFP融合基因的慢病毒载体在体外转染小鼠肝癌细胞与正常肝细胞，同时也转染了大鼠体内的肝癌细胞，结果表明慢病毒载体不仅在体内外都能有效地转染肝癌细胞，并且对正常的肝细胞不起作用，而且转染癌细胞后有效抑制了癌细胞的生长而不引发肝脏毒性效应。类似的，Yu等人以前列腺癌细胞为研究对象，把受雄性激素调控并在前列腺特异表达的启动子和另一EGFP基因插入慢病毒载体中，然后分别转染癌细胞和正常细胞。结果只在癌细胞中观察到了EGFP的表达，雄性激素还能促进EGFP的表达而不改变其表达特异性。
在抗HIV方面：Banerjen等人将抗Rev的siRNA基因转入CD34+造血干细胞中，然后让这些干细胞在体外分化为T细胞，在SCID-hu小鼠体内分化为巨噬细胞。接着他们用HIV-1去感染这些T细胞和巨噬细胞，结果发现这两种细胞都明显的抗HIV-1。除此之外，利用慢病毒载体将表达反义的核酸基因转入T细胞和CD34+细胞也可以达到HIV-1的效果。Davis等人设计开发了一种HIV-1来源的载体VRX496，该载体能有效的转染人CD34+细胞和CD4+淋巴细胞，同时还携带了一段反义序列能有效地抑制HIV外壳蛋白的表达，从而抑制HIV的复制。
结合RNAi进行功能研究：慢病毒载体结合RNAi技术不仅可以用于基因治疗，而且可以研究细胞中特定基因的功能。并且两种技术的结合还可以克服由dsRNA引起的干扰素效应。Katayama等人利用慢病毒载体介导的shRNA表达系统研究过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)的作用机制。PPARγ在脂肪细胞分化及其它多种细胞的生理过程中都起着重要作用，所以他们先找到可以抑制PPARγ表达的shRNA，然后用慢病毒载体将其导入3T3-L1细胞，PPARγ的表达被抑制后，前脂肪细胞向脂肪细胞的转化受到了明显的抑制。这个结果为进一步阐明PPARγ的作用机制奠定了基础。除此之外，慢病毒载体还可以构建RNAi文库来实现大规模的功能基因组的研究。
在转基因动物方面的应用：慢病毒载体对培育转基因动物模型有很好的作用，它将目的基因导入宿主细胞后经过反转录、整合等，使优势基因能在宿主体内得到良好的表达。这样就能得到需要带有目的基因的个体。由于其操作简单，对宿主细胞有良好的适应性，使得慢病毒系统在转基因动物方面有着良好的应用前景。