gRNA打靶效率检测载体

CRISPR/Cas9载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一,可以快速有效地在基因组的靶位点产生突变(另外两种应用广泛的是ZFN和TALEN)。这些质粒载体编码序列特异性RNA介导的DNA核酸酶(或切口酶),可用于编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9属于RNA引导的DNA核酸酶,是天然原核免疫系统的一部分,赋予细菌对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抗性。在细胞内,Cas9核酸酶与引导RNA(gRNA)形成复合物,该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上,然后切割基因组中的靶位点。

常规质粒gRNA特异性检测载体设计用于测试CRISPR/Cas9对一个或多个gRNA靶序列的切割效率。该系统允许用户通过比对多个gRNA靶位点来筛选出最有效的CRISPR/Cas9靶点。

常规质粒gRNA特异性检测载体系统的基础是位于强启动子EF1A下游的无活性且分隔开的EGFP ORF。将待测试的gRNA靶位点克隆在两个不完整的无功能性的EGFP ORF(称为EGFP-L和EGFP-R)之间。EGFP-L由EGFP ORF的上游468 bp组成,EGFP-R对应于EGFP ORF下游的268 bp-720 bp。EGFP-L的3'末端的200 bp与EGFP-R的5'末端的200 bp具有序列同源性。

当常规质粒gRNA特异性检测载体单独转染到细胞中时,不会观察到绿色荧光,因为EGFP-L和EGFP-R都不编码功能性荧光蛋白。然而,如果将该载体与Cas9和相应的gRNA载体一起共转染到细胞中,则gRNA-Cas9复合物将被募集到EGFP-L和EGFP-R之间的gRNA靶序列,从而切割产生双链DNA断裂(DSB),随后EGFP-L和EGFP-R的同源区域发生同源重组。同源重组将产生完整的功能性EGFP ORF,继而产生绿色荧光蛋白。在该系统中,可以在EGFP-L和EGFP-R之间串联克隆多个gRNA靶位点(每个都应包含PAM序列),并且可以通过与Cas9和相应的gRNA共转染分别测试。通过分析产生EGFP荧光细胞的效率,比较不同gRNA靶位点被CRISPR/Cas9切割的效率。

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