慢病毒载体潜在的不利因素

慢病毒载体的主要不良反应实际上是所有逆转录病毒载体的共病，因为它们都是利用逆转录病毒的生存周期，将病毒基因组整合到宿主细胞基因组。一旦感染，这些病毒的单链RNA基因组反转录为双链DNA中间体，然后整合在宿主基因组DNA，从而复制病毒。病毒可以将包含病毒编码区侧链的长末端重复序列同时插入宿主基因组中的多个位点。

一方面必须考虑的不良影响是在载体生产过程中，具有复制能力的慢病毒的产生和传播，这些必须在进行临床试验GMP生产中解决。这种具有复制能力的慢病毒的产生主要是通过同源重组序列之间发生重叠。虽然在亲嗜性逆转录病毒或者双嗜性逆转录病毒包膜感染的具有分裂功能的逆转录病毒整合细胞系中已经检测到了具有复制能力的逆转录病毒，但是目前并没有关于慢病毒载体细胞中出现具有复制能力慢病毒的报道。这可能取决于载体的结构，失活载体是不产生具有复制能力慢病毒的基础（见下文）。

另一方面需要考虑的不良影响是所有的逆转录病整合病毒DNA到宿主基因组中，有可能插入临近基因序列的突变区或者转录区的风险。在很多情况下，逆转录病毒的整合都会产生不良影响，例如肿瘤的形成。在γ逆转录病毒载体转染后，LMO2基因（已知的原癌基因）由长末端长度序列的增强子插入激活。这种情况在两个独立进项的X连锁重症联合免疫缺陷临床实验中的进行基因治疗的五个白血病病人中出现。小鼠急性随性包白血病也是因为逆转录病毒载体基因转插入到临近一个原癌基因后造成插入激活启动了发病机制。另一项研究发现，虽然还不清楚是否与发生插入突变或转录激活有关，但是在新生小鼠体内随着EIAV慢病毒载体（马传染性贫血病毒）携带的病毒基因的转移，肿瘤的发病率增高。最近，克隆优势化已经在一个使用转导携带染色质绝缘体的失活HIV-1慢病毒载体造血干细胞进行临床试验的受试者逐渐体现出来。克隆优势化的出现是由于整合到基因组上的载体基因可编码一个与良性和恶性肿瘤相关的HMGA2蛋白。研究发现HIV阳性患者癌症发生的风险也明显提高，这包括HHV-8感染相关的卡波西肉瘤和EBV感染相关的伯基特淋巴瘤，这主要是由于免疫缺陷病人再次被这些外来的病毒造成基因激活所导致的，甚至在极其罕见的情况下，也会发生HHV-1感染相关T细胞淋巴瘤。有证据表明，在HIV-1感染相关的T细胞淋巴瘤患者中，病毒已经整合到CD4 T细胞基因组c-fes癌基因的上游，HIV-LTR作为c-fes的增强子元件导致了fes表达的上调。

研究早期，人们认为逆转录病毒整合到宿主基因组并不是一个纯粹的随机事件。目前的研究表明，γ逆转录病毒和慢病毒都优先整合到具有转录活性的基因。HIV-1整合是受许多不同的因素影响的，这些因素包括碱基组成，Alu重复序列和DNase I超敏感位点。HIV-1整合是由慢病毒整合酶的细胞结合的伴侣LEDGF/p75来控制的。已经证明γ逆转录病毒载体优先整合到启动子和CpG岛。关于RV和LV的整合概况得到了更详细的研究，证明整合偏好可以影响基因治疗应用中整合偏好可以影响潜在载体遗传毒性。转导CD34+造血干细胞/祖细胞的多种刺激方法中，最主要的区别可能会影响患者基因的整合。然而，一份转导RV 和LV人类造血干细胞的体内定位研究显示，RV具有更高的几率插入原癌基因，癌症相关的突变位点和调控生长的基因位点，而不是LV。这暗示我们LV整合到人类基因潜在危险区域的倾向较低。通过嵌合载体在体内遗传毒性试验即肿瘤易感小鼠模型得到的结果，也发现了RV和LV的致癌潜能的差异性，这种差异性也可以通过研究RV的优先靶向基因来解释。这份研究也证明了LTRs在整合载体的遗传毒性潜力中起到的决定性作用，也支持了在病毒载体设计中，失活LTRs选择的必要性（见下文）。

因为内在整合位点的选择，HIV-1衍生的LV在导致肿瘤发生发面比RV更具安全性。然而，LV插入具有转录活性的基因仍然是有很高的风险，因为其有可能造成常的抑癌基因杂合性缺失和/或正功能的丧失。此外，邻近的基因组序列的转录激活相关的风险也必须被重视，因为体外研究表明载体的增强子元件在LV的插入转化能力有决定性的作用。因为在临床试验中，使用γ逆转录病毒载体基因转导产生的不良反应有三年的潜伏期，但是HIV衍生的LV的相对安全性并有没有进行长时间的随访，因此需要更多的病人进行治疗和研究。

使用LV两一个需要考虑的不良影响是构建载体对未经修饰的（非目标）细胞或者组织的动员和后续传播。当载体保留其完整的LTR，并且转染过程中有不断包装蛋白提供，那么动员就会发生，这就类似于HIV病毒感染或者其他野生型慢病毒的感染。在体外可以从野生型HIV感染的T细胞系或者人原代淋巴细胞中分离出来。最近通过第一期临床试验发现，在慢性HIV感染患者中，使用LV转染抗HIV-1的基因，也会出现HIV衍生LV的有条件复制造成的短暂动员。在5个病人中有四个人血浆中都检测到了载体RNA的存在。然而，这里应该指出的是这个载体不包含LV研究中常用的增强子敲除SIN LTR区域（见下文）。载体传播是大多数基因治疗应用的一个重要问题，而这个临床试验中出现的载体动员现象有利的证明了载体（抗HIV-1基因转录子）是可以传播到其他T细胞的。然而，虽然野生型HIV感染细胞的范围较小，但是这些发现证明了接收LV基因治疗后感染HIV病人载体动员问题。