文献解读 | CIRC-AKT 3通过改变miR-296-3p/E-cadherin信号抑制肾透明细胞癌转移

论文:Circ-AKT3 inhibits clear cell renal cell carcinoma metastasis via altering miR-296-3p/E-cadherin signals(CIRC-AKT 3通过改变miR-296-3p/E-cadherin信号抑制肾透明细胞癌转移)

背景

MiRNAs是一种小的非编码RNA,也负责mRNA功能的调控,许多miRNAs在肾癌的发展过程中起着关键作用。

MiRNAs与参与转移性肾细胞癌的圆环RNA之间的特异性相互作用尚未得到充分讨论,因此,深入了解miRNAs及其潜在的转录调控因子在肾转移过程中的作用可能有助于阐明ccRCC的发病机制。

新出现的证据表明肿瘤侵袭性与上皮间充质转换(EMT)有关。EMT促进癌细胞的成瘤进程,增加细胞迁移和侵袭,“干细胞”,抑制细胞凋亡和衰老。EMT的特点是细胞粘附连接功能的丧失。

粘附连接主要由一种跨膜钙依赖性糖蛋白E-cadherin(基因ID:cdh 1)组成,它在细胞的机械偶联中起重要作用,从而在局部和组织水平上保持完整性。

此外,E-cadherin还通过其细胞质结构域与catenin家族的相互作用参与调节细胞死亡/增殖的细胞信号。加在一起,E-cadherin被确立为一种抑癌剂,这一点也就不足为奇了。

此外,它的功能丧失与肿瘤的侵袭和转移有关。从而导致许多癌的预后不良。在ccRCC中,临床标本中经常观察到E-cadherin表达的放松管制而E-cadherin的丢失被认为是早期的致癌事件。

另一方面,E-钙粘素的恢复抑制肿瘤的进展,包括在各种体外和体内肿瘤模型中的转移。然而,在ccRCC中,miRNA和圆环RNA对E-cadherin的调控网络尚不清楚。

在本研究中,我们通过微阵列分析和qPCR阵列鉴定了一种来源于AKT 3基因位点的新的圆环RNA,称为CIRC-AKT 3,该基因在ccRCC组织和细胞系中稳定下调。

功能检测显示CIRC-AKT 3与ccRCC细胞的转移呈负相关。机理研究表明,CIRC-AKT 3可能作为miR-296-3p的海绵,上调E-cadherin的表达,从而抑制ccRCC的体外迁移、侵袭和体内转移。CIRC-AKT 3可作为抑制ccRCC转移的治疗靶点。

circRNA微阵列分析显示crRNA在透明细胞肾细胞癌中的表达谱

为了研究crcRNA在ccRCC中的表达谱,我们用Arraystar人圆环RNA阵列V2(Arraystar Human CircRNA Array V2)芯片分析了3对与癌旁正常组织配对的ccRCC组织标本。

在ccRCC组织中,共有53个cRNAs被显著上调,30个crna被下调(由cfc(折叠变化)≥2和crcRNAs过滤)。P < 0.05) ,详细列于其他档案中。这些环RNA的解除显示了它们在ccRCC进展中的潜在作用,需要进一步的研究。

CIRC-AKT 3在ccRCC细胞迁移和侵袭中的抑制作用

为了探讨CIRC-AKT 3在ccRCC中的作用,我们使用了三个siRNA寡核苷酸来定位该圆环RNA独特的背剪接连接。反义剪接连接siRNAs可显著降低CIRC-AKT 3基因表达,而不降低AKT 3 mRNA水平。

此外,用Geneseed方法合成了过表达圆环AKT 3的慢病毒质粒,并通过qRT-PCR检测其转染效率。此外,在改变CIRC-AKT 3的表达后,AKT 3蛋白保持不变。MTT分析显示CIRC-AKT 3不影响ccRCC细胞的增殖(附加档案)。

然而,在CIRC-AKT 3基因敲除后,OSRC-2细胞表现出较强的迁移能力,如伤口愈合实验所示,反之亦然。Transwell法进一步证明,CIRC-AKT 3的沉默显著促进了OSRC-2细胞的迁移和侵袭,其中含有较高内源性CIRC-AKT 3。

同时,CIRC-AKT 3的过表达明显抑制内源性CIRC-AKT 3细胞的迁移和侵袭能力。(f-h)加在一起,结果如图所示。C-h显示,CIRC-AKT 3通过抑制ccRCC细胞的迁移和侵袭而发挥保护作用。

CIRC-AKT 3通过恢复E-cadherin的表达抑制ccRCC的迁移和侵袭

为了检测CIRC-AKT 3在ccRCC中的作用机制,我们对某些与ccRCC转移相关的基因进行了研究,以获得一些线索。其中,E-cadherin作为一个转移相关基因,受CIRC-AKT 3的调控,如Westernblotting结果所示。

越来越多的证据表明,E-cadherin在ccRCC转移中起着关键的保护作用。有趣的是,根据对TCGA数据库的分析,E-cadherin在肿瘤组织中的mRNA水平大部分低于匹配的非肿瘤组织。

E-cadherin在ccRCC组织中的表达与CIRC-AKT 3表达水平呈正相关(P<0.05)。p < 0.005, r = 0.4004) 。这些数据提示E-cadherin在介导CIRC-AKT 3依赖性抑制ccRCC迁移和侵袭中起着关键作用。

CIRC-AKT 3的体内修复抑制ccRCC转移

进一步在体研究CIRC-AKT 3的强制表达对ccRCC转移的调节作用。将稳定表达荧光素酶(OSRC-2-荧光素酶)的OSRC-2-荧光素酶(OSRC-2-荧光素酶)细胞接种于BALB/c裸鼠肾下包膜下,经普罗霉素筛选后,将OSRC-2-荧光素酶载体细胞(OSRC-2-荧光素酶载体细胞)注射到BALB/c裸鼠肾下包膜下。

结果显示,注射CIRC-AKT 3高表达细胞(OE-CIRC-AKT 3)的裸鼠转移灶比载体组少。此外,与对照组相比,OE-CIRC-AKT 3组E-cadherin表达水平明显升高免疫组织化学染色(IHC)结果显示,与对照组相比,OE-CIRC-AKT 3肿瘤中E-cadherin的表达明显增强。这些结果表明,强制表达CIRC-AKT 3能有效地抑制ccRCC在体内的转移。

讨论

在以前的研究中,miR-296-3p被报道参与了许多癌症的转移。它是一种癌基因,促进前列腺癌的迁移和侵袭。但作为肺腺癌转移的抑制因子。然而,它在CCRCC中的作用从未被研究过。

我们确定miR-296-3p促进了ccRCC细胞的迁移和侵袭,CIRC-AKT 3可以逆转这一现象。重要的是,miR-296-3p通过与E-cadherin的3‘-UTR结合,通过荧光素酶报告分析和Westernblotting分析,证明可以降低E-cadherin的表达。


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