文献精读 在胰腺癌中，选择性丙氨酸转运蛋白是一个可靶向的代谢位点
by ZYM
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知识点积累
实验结果
1.胰腺腺癌细胞PDAC与胰腺星形细胞PSC的丙酮酸代谢差异
作者在先前的研究中表明，PSC与PDAC细胞之间存在丙氨酸的代谢串扰，PSC可以通过分泌丙氨酸支持PDAC的生长，而PSC的丙氨酸分泌依赖于PSC自噬（PMID：27509858，DOI：10.1038/nature19084）。作者在之前的工作基础上，进一步探索PDAC与PSC具体的丙氨酸代谢串扰方式。作者对人胰腺癌细胞系（hPSC#1、PANC1、PANC10.05、PANC3.27、PATU 8988T、PATU8902、MiaPaCa2、HPAC）、鼠胰腺癌细胞系（mPSC#1、HY19636、HY15566、MPDAC4）中PDAC和PSC进行丙氨酸分泌、摄取通量的定量分析，发现细胞在缺乏丙氨酸的DMEM培养基中为净分泌，当添加了1mmol/L的丙氨酸后，出现了摄取的增加（图1A）。同位素示踪法（图1B）用C13标记丙氨酸，发现PSC交换的丙氨酸通量为先前测得净分泌通量的3倍，并且交换量超过PDAC的摄取量。
相对PSC，PDAC细胞表现出了显著的丙氨酸消耗和独特的转运机制。作者假设环境中的丙氨酸影响了PDAC细胞内的丙氨酸需求，通过抑制利用或转运，可以限制癌细胞摄取丙氨酸。利用C13或N15进行同位素示踪，评估丙氨酸在肿瘤细胞内的代谢，发现在三羧酸循环、脂肪酸合成、转氨基作用等中，均有显著检测到标记物（图1C）。这也提示了丙氨酸对PDAC中的代谢合成途径有重要的参与，证实在PDAC细胞中，丙氨酸的来源可以是从头合成，也可以是从环境中摄取。
丙氨酸的合成分解需要谷丙转氨酶（GPT），细胞质中是GPT，线粒体中是GPT2。作者对两者进行量化，发现GPT2的含量较高（图1D），推测丙氨酸的合成利用可能发生在PDAC的线粒体中。相对GPT和GPT2高表达的细胞，在GPT和GPT2含量较低的细胞中（PANC1，HPAC），C13丙氨酸在三羧酸循环的产物中含量较少。上述实验表明丙氨酸的从头合成主要是利用PDAC线粒体中的丙酮酸。由于在绝大多数的癌症中（如肺、结肠、肾）等，线粒体丙酮酸转运蛋白（MPC1/2）表达下调或缺失，即促进了有氧糖酵解（Warburg效应）。而在人PDAC细胞系中MPC1/2的表达，则提示PDAC存在替代机制，来减少线粒体对丙酮酸的摄取需求。
作者随后使用MPC2抑制剂UK-5099处理PDAC细胞，并对丙氨酸的代谢转运进行测定（图1E），发现丙氨酸的含量及净分泌都发生了显著降低（图1F1G）。通过补充丙氨酸则可以挽救这一变化，丙氨酸的摄取显著增多（图1G）。另外同位素示踪发现，MPC的抑制显著抑制了由丙氨酸衍生的乳酸水平，从侧面也提示了丙酮酸衍生的有氧糖酵解水平提升。
作者假设在丙氨酸合成收到抑制时，PDAC为了维持胞质内丙氨酸水平需要依赖细胞膜上的丙氨酸转运蛋白，PSC-PDAC之间存在特殊的转运机制以维持丙氨酸的平衡。作者接下来对PDAC和PSC细胞进行定量蛋白组学分析及主成分分析，共鉴定了40种蛋白，并从中分析筛选在PDAC和PSC细胞中高表达的SLC38A2、SLC1A4。作者选取了3种对丙氨酸需求不同的细胞系（PANC1，MiaPaCa2，HY19636），利用CRISPR / Cas9靶向SLC38A2，当敲除SLC38A2时，丙氨酸的分泌量出现显著增加（图2C）。在培养基中添加了丙氨酸后，SLC38A2缺陷的PDAC细胞系相对于对照组（sgTom）仍存在分泌增加（图2D）。通过对细胞丙氨酸含量的测定，发现SLC38A2缺陷的细胞中丙氨酸水平显著低于对照组（sgTom）（图2F）。抗sgRNA的SLC38A2cDNA解救实验则可以使PDAC中丙氨酸的水平恢复。因此丙氨酸的被动转运不足以维持PDAC细胞中线粒体的丙氨酸反应。同时，SLC38A2缺陷的细胞会增加细胞对丙氨酸的被动丢失。综上，SLC38A2是PDAC细胞维持丙氨酸水平所必需的，并且是调节丙氨酸流入细胞的主要动力（图2H）。
作者在先前的研究中，发现在营养充足的条件下，补充丙氨酸并不会刺激PDAC细胞的增殖。而在低氨基酸培养基中培养的PDAC细胞，补充丙氨酸可将PDAC细胞增殖持续提高约15％至30％；并且在营养有限的条件下，SLC38A2的缺失会减弱丙氨酸的促生长作用（图3A）。此外，在营养丰富的条件下，SLC38A2的缺失显着降低了细胞增殖和克隆形成的潜力。
但是两种情况下，被动转运出去的丙氨酸都有所增加。因此，猜测由于丙氨酸摄取的缺乏，导致丙氨酸利用率降低和被动损失增加，这一转变进一步导致了PDAC中的代谢危机和增殖潜力的降低。
另外，在SLC38A2缺失的细胞中，总氨基酸水平显著降低（图3D），通过抗sgRNA的cDNA，对丙氨酸则可以完全解救。由于SLC38A2同时也可以转运丝氨酸、甘氨酸等，而在SLC38A2缺乏的解救实验中，只有丙氨酸的通量完全逆转，表明其他的底物还可以通过其他转运蛋白进行调控。
由于总氨基酸水平显著降低，作者猜测着可能是因为SLC38A2缺失导致丙氨酸转运障碍，进而进一步影响了其他氨基酸的转运。作者建立了CRISPR/Cas9介导的SLC38A2敲除，以及dox诱导的抗sgRNAcDNA模型，进行代谢组学研究。在dox诱导期间，丙氨酸水平能够维持，在撤药后则出现丙氨酸、SLC38A2底物水平的迅速下降，接近敲除水平（图3G）；此外还能观察到其他氨基酸（如，天冬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸）水平的下降。上述实验表明，SLC38A2转运了小的中性氨基酸，包括丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸，但是只有丙氨酸通量是变化较大，证明了SLC38A2对丙氨酸转运的特定性，以及对其他氨基酸转运的继发调控。
4.丙氨酸被动转运的影响及代谢补偿
作者继续以对照模型（sgTom）、CRISPR/Cas9介导的SLC38A2敲除模型、dox诱导的抗sgRNAcDNA模型，探索其对氧化还原等代谢的影响。作者发现，SLC38A2缺失细胞显着抑制了增殖和克隆形成潜能（图4B、C）。丙酮酸是胞质中NAD 再生所必需的（通过活化的LDH），并提供线粒体NADH（通过活化的PDH）以实现电子传输链（ETC）功能（图3I）。作者假设增加的丙酮酸转运入线粒体后会导致溶质和线粒体NAD（H）失衡。结果在SLC38A2基因敲除后，细胞的外酸化率（ECAR）和氧消耗速率（OCR）显著减少约35％，而对照组（sgTom）没出现类似现象。这表明糖酵解和呼吸潜能均大幅降低（图4D）。
由于呼吸潜能的降低，天冬氨酸水平降低了90%（图4D），而丙酮酸或其他电子受体（例如，α-酮丁酸酯）可以通过再生NAD 来挽救ETC缺陷型细胞的增殖能力（图4E）。
作者使用C13或N15丙氨酸来培养SLC38A2敲除的细胞，发现线粒体三羧酸循环和转氨基作用的产物中，同位素标记均显著降低（图4G）。假设其他氨基酸可以弥补这一点，使用N15谷氨酰胺培养后，上述同位素标记则升高（图4G）。上述证明了谷氨酰胺在SLC38A2敲除细胞中的运输不受到限制，但是这可能与谷氨酰胺摄取量最小有关（图3F）；但是上述标记中，天冬氨酸未出现增加，可能是丙氨酸缺乏引起的次级代谢障碍。将敲除细胞在富含氨基酸的培养基（DMEM/F12）中培养，其克隆形成、增殖得到了明显的恢复（图4H）。综上所述，SLC38A2的缺失引发了丙氨酸代谢的缺陷以及其次级代谢障碍。
5.SLC38A2在人和小鼠PDAC中高度表达，并定位于细胞膜上
作者接下来在小鼠模型、临床样本上进行验证。对小鼠胰腺癌模型（KPC，LSL-Kras G12D；Trp53 lox / ；p48Cre）进行IHC染色后，发现SLC38A2在PDAC中强染色，PSC中则是低染或无染色。在临床样本中，SLC38A2在大多数人的肿瘤样本中均在PDAC细胞中表达（114/136肿瘤；约84％）。因此PDAC细胞可以激活SLC38A2的表达，以促进丙氨酸代谢串扰。为了证实SLC38A2的定位，作者对PDAC细胞核正常胰腺导管上皮细胞（HPDE）等进行染色，发现在PDAC细胞中，SLC38A2定位于细胞膜上；而正常细胞则是定位于细胞质中（图5F）。虽然SLC38A2普遍存在，但是大规模的CRISPR基因敲除研究中，并未被认为是常见的必需基因，在非恶性细胞系（如hPSC＃1、mPSC＃1、IMR-90、HPDE）中敲除SLC38A2不会引起明显的生长缺陷（图5G），因此靶向SLC38A2可能为肿瘤的治疗提供一个潜在的位点。
作者接下来探索星状细胞PSC如何分泌、并为PDAC提供丙氨酸。作者敲除SLC1A4后，导致PSC分泌丙氨酸量显著降低，但是对其他报道的SLC1A4底物氨基酸（如丝氨酸和苏氨酸）没有显著影响。同时，在PSC细胞中敲除SLC1A4则未提示细胞增殖影响（补充图10E）。
7.小鼠成瘤模型验证