人-胃癌旁组织悬液制备
组织背景介绍
胃,居于膈下,腹腔上部。胃的上部称上脘,包括贲门;中部称中脘,即胃体部位;下部称下脘,包括幽门。
正常人的胃壁由四层结构组成,从内向外依次是粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜层。粘膜的浅层是上皮组织,有很多腺体,分泌胃酸,对食物进行化学性的消化。
粘膜层又可分为上皮,固有层和粘膜肌层。在正常胃粘膜中,上皮是由一组复杂的细胞系组成,包括粘液细胞、分泌细胞和内分泌细胞,它们协同工作以维持组织内环境平衡;固有层由结缔组织构成,其中含有大量的胃腺,分别是贲门腺、幽门腺、胃底腺。胃底腺由多种腺细胞组成,主要是主细胞和壁细胞;粘膜肌层为薄层平滑肌。粘膜下层由疏松结缔组织构成,含有淋巴细胞、肥大细胞及神经丛、血管和淋巴管。肌层发达,由内斜、中环和外纵三层平滑肌构成。外膜为一层浆膜,由间皮和少量的结缔组织构成。
本方案中,选用胰蛋白酶进行解离,胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶,对碱性氨基酸、精氨酸和赖氨酸的羧基参与的肽键具有特异性,可使天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和黏蛋白等水解为多肽或氨基酸。
材料和试剂耗材
实验流程
取样后置于冰上的培养皿中,将组织切碎成0.5-1.5 cm3的小块;
将10 mg左右切碎的组织转移到试管中。
除去上清液,加入1 mL胰蛋白酶-EDTA(0.25 %),用保鲜膜密封离心管盖,并在37℃下振荡孵育30 min。
孵育后,轻轻研磨样品,使用血清移液管将样品上下吹打6-8次,未能消化的组织块沉降到离心管底部。
细胞悬液过30 μm筛于离心管中,离心管置于冰上,用预冷的PBS/BSA 0.04 %冲洗滤膜,并同时添加预冷的0.04 % PBS/BSA至总体积为10 mL。
350 g,4℃离心5 min,去除上清液。
如果组织含有大量的红细胞,需进行裂红操作(步骤7-10),添加1 mL红细胞裂解缓冲液,置于冰上2 min。
2 min后,加入5 mL预冷的PBS/BSA 0.04 %中和;
4℃,350 g离心5 min,去除上清,加入0.04 %预冷的PBS/BSA至10 mL。
4℃,350 g离心5 min,尽可能多的去除上清。
在冰上,用100 µL预冷的0.04 % PBS/BSA重悬细胞悬液,采用台盼蓝或荧光计数法对细胞数量和活性进行检测。
结果展示
所获细胞悬液:活率大于90 %,结团率低,背景干净。