【中国实用妇科与产科杂志微信专栏】之556 胎儿游离DNA预测自发性早产研究进展
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本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》
2020年9月 第36卷 第9期
作者姓名：兰 侠1，韩 磊2，周 玮1
关键词：胎儿游离DNA；自发性早产；炎症反应；Toll样受体9；预测指标
自发性早产约占全部分娩总数的10%，且发生率逐年升高，是造成新生儿患病和死亡的主要原因之一，也是严重影响围产儿预后的主要因素。在存活的早产儿中，约有1/4合并严重或难治性疾病，其造成了沉重的社会和家庭负担，但发病机制不明［1］。目前，有关自发性早产的预测和发病机制的研究持续升温，但尚缺乏有临床循证医学证据的治疗方法以及有针对性的预测标志物［2］。以往的研究及假说认为，早产的发生是分娩提前启动所致，这一病理过程涉及复杂的多系统相互作用，最终导致子宫收缩和绒毛-蜕膜之间的接触面分离，此时胎盘的屏障功能受到严重破坏，释放大量的不良因子和囊泡类成分进入母体［3］。因此，检测进入母体中的胎儿相关标志物为自发性早产的预测开辟了新的思路。
1997年中国香港的卢煜明教授团队发现了孕妇外周血中的胎儿游离DNA（cff-DNA），开启了新生儿出生缺陷的无创产前检测的新时代［4-5］。近些年来，关于孕妇循环中cff-DNA的研究越来越多，现有的证据表明，cff-DNA的增加与早孕期妊娠丢失、子痫前期、胎儿生长受限、先兆早产、早产等不良妊娠结局密切相关。cff-DNA可能发展成为这些不良妊娠结局的潜在预测标志物［6］。另一方面，也有研究发现cff-DNA确实具有诱发炎症反应、促进分娩启动级联反应的作用，从机制上肯定了cff-DNA作为自发性早产预测因子的可能性［7］。
01
血浆cff-DNA的促炎症特性
外周血中的DNA主要是由已经死亡的细胞释放，大多数与血细胞表面相粘连，只有少数在血清中呈游离状态，且体内半衰期短，半小时即可被清除。健康人外周血中的cff-DNA主要来源于造血系统，能够发挥一定的生物学功能［8-9］。对于患有感染性、缺血性、自身免疫性、肿瘤、肥胖等疾病的患者，以及女性妊娠期间，血清中cff-DNA的水平显著升高，但机制不明［10］。cff-DNA的水平升高可能与组织坏死、败血症、肿瘤及胎盘组织中大量细胞异常转化有关［11］；也可能是宿主对外源性（病毒或细菌）或致病性DNA的一种保护性防御反应，以增强机体免疫功能［12］。
近年来有研究发现，细胞中存在两种与cff-DNA有关的信号转导相关通路，即Toll样受体9（TLR9）途径和干扰素基因刺激因子（STING）途径［1］。cff-DNA可能通过这两种途径发挥促炎性的级联反应，但其是否能直接诱导分娩时的级联反应尚未明确。实验研究发现，TLR9能够以较高的亲和力识别并结合甲基化程度较低的胎儿和胎盘DNA，导致胎鼠的流产率升高，但在TLR-9敲除的小鼠中，这种效果显著降低［13］。自然流产的人类蜕膜中TLR9的表达升高，也进一步说明TLR-9在早产、流产等不良妊娠中具有关键作用［14］。TLR9被DNA活化后将通过白细胞介素（IL）-1受体相关激酶信号通路促进髓样分化因子88的表达，进而导致下游的肿瘤坏死因子（TNF）-α受体因子6和转化生长因子β相关激酶1的激活，进一步激活核因子（NF）-κB经典信号途径，促使胞内基因转录改变和促炎性细胞因子干扰素（INF）-α的产生［15］。可见，cff-DNA可以通过TLR9途径引起下游的炎症反应，但是否能够通过其他分子信号途径引发体内炎症反应尚不明确，需要进一步研究证实。
在体动物实验观察到cff-DNA可以激活非孕女性的外周血单核细胞，导致IL-6等炎症细胞因子的产生，进而激活TLR9［13］。若将cff-DNA注入小鼠腹腔则不会导致小鼠巨噬细胞发生系统性炎症反应，也不会引起自发性早产和体外炎症反应［16］。国内有研究显示，向孕鼠尾静脉注射胎盘源性的微泡，可以导致正常孕鼠发生血压升高、流产及子痫样抽搐，全身主要器官及免疫系统也会发生与子痫前期相一致的改变，提示cff-DNA须进入母体外周循环中才具有促炎性和诱发早产的作用［3］。因此，cff-DNA必须在母体循环中、处于妊娠期母胎界面特殊的免疫状态下才能发挥促炎症作用。cff-DNA的促炎特性及其所致的妊娠结局如何尚需要深入研究。
02
胎儿cff-DNA的生物学特性
正常妊娠过程中，胎盘合体滋养层和细胞滋养层细胞发生凋亡或坏死（如感染所致）时会产生cff-DNA［17］；胎盘来源的微粒（如外泌体、囊泡）也可能包含或黏附有cff-DNA。进入母血中的cff-DNA浓度与孕龄显著相关，孕周增加后胎盘体积增大，同时凋亡的滋养层细胞亦增多，导致母血中cff-DNA浓度升高；从妊娠第10至第21周，母血中的cff-DNA浓度每周升高0.1%，妊娠第21周后每周升高1%［18］。母体外周循环中的cff-DNA会在分娩后2h内清除［19］。这些cff-DNA的生物学特性为其成为不同孕周早产的标志物奠定了基础。
近年来的全基因组定量测序研究显示，肥胖孕妇血液中cff-DNA的浓度低于相同孕龄的正常孕妇，可能是由于肥胖导致孕妇外周血容量增加进而产生了稀释作用［20］。相反，妊娠剧吐、早产、胎儿畸形、子痫前期、HELLP综合征、胎儿生长受限、妊娠期糖尿病和前置胎盘等妊娠并发症患者，由于母胎界面的免疫炎症反应、胎盘功能不全、胎盘缺血缺氧或胎盘附着位置不良等继发胎盘灌注不足，导致滋养细胞的裂解、坏死增加，释放进入外周血中cff-DNA的浓度也会高于相同孕龄的正常孕妇［6］。因此，孕妇外周血cff-DNA浓度的差异可以提示胎盘的病理和生理状态，进而反映是否有早产风险。当然，应用孕妇外周血cff-DNA浓度作为早产预测指标需要根据不同的妊娠相关合并症和并发症进行分类对比。
另外，有研究认为，母血中胎盘来源与非胎盘来源cff-DNA的比例也与孕周及分娩状态有关：在妊娠第10~36周的非分娩期正常孕妇体内，cff-DNA在外周血总cff-DNA中的百分比约为19%~26.2%，非胎盘来源的cff-DNA最高可达73.8%；而分娩期正常孕妇外周血中胎盘来源的cff-DNA占75.3%，非胎盘来源的cff-DNA仅占不足25%［19］。这种在分娩期和非分娩期cff-DNA的巨大差异为cff-DNA成为早产分娩的预测因子提供了可靠依据。
03
胎儿cff-DNA与自发性早产的预测
既往研究表明，母体循环中cff-DNA的浓度随孕周延长而呈现升高趋势，在妊娠晚期，cff-DNA的浓度与孕周呈正相关，并在临近分娩前升至峰值；同样，自发性早产的分娩也与母体外周血cff-DNA的浓度升高具有相关性［7］。更为重要的是，在出现自发性早产的症状和相关体征之前，这些孕妇血浆中的cff-DNA浓度就已经升高，显著高于相同孕龄的健康孕妇；对这些孕妇进行保胎治疗后，母血中cff-DNA浓度出现一定程度的下降，说明早产与母体外周血cff-DNA之间存在良好的一致性［21］。先兆早产的转归研究也发现，最终发生早产的孕妇其血浆cff-DNA的平均浓度是最终未发生早产孕妇的3倍，差异具有统计学意义，提示孕妇血浆cff-DNA升高是先兆早产患者可能发展成早产的可靠征象［22］。上述结果提示：母血cff-DNA浓度具有发展为自发性早产启动预测指标的潜力，但需要排除胎龄和妊娠相关合并症及并发症等影响cff-DNA水平的混杂因素。
子宫颈长度缩短和子宫颈口的开放是自发性早产发生的重要临床表现。正常孕妇的子宫颈长度会随着孕龄的延长而逐渐缩短，但临产前一般都维持在2.5cm以上。早产孕妇的子宫颈长度较相同孕龄的正常孕妇显著缩短［23］。早产孕妇在先兆早产阶段，子宫颈长度呈逐渐缩短的趋势，母体外周血中的cff-DNA则不断升高，因此，母血cff-DNA与子宫颈长度呈明显的负相关［23］。这为母血cff-DNA浓度发展成为早产的预测指标提供了更加精确的参照指标。
既往定量研究分析了无症状孕妇从早孕至妊娠第25周循环中cff-DNA浓度高低与不良妊娠结局之间的关系，提示母体外周循环中cff-DNA的水平与胎儿生长受限、妊娠期糖尿病等多种妊娠异常情况相关［21］。因此，cff-DNA浓度用于预测自发性早产需要排除一系列干扰因素，针对患有不同并发症和合并症的孕妇需采用不同的标准。当然，由于不同孕周母体循环中cff-DNA的波动范围不同、纳入研究的样本量较大且合并症多、异质性大、标本的存储和测定方法各异，有少数研究甚至认为，母血中cff-DNA的水平与早产的发生没有直接关系或呈负相关［24］。所以，在研究中先将孕龄、体重或体重指数、孕期合并症和并发症等混杂因素进行分类，再对母血中的cff-DNA进行检测和分析才能判断其是否具有预测早产的临床价值。
04
结语
现有的证据提示，孕妇外周循环中的cff-DNA可能是通过TLR9信号途径引发母胎界面的炎症反应，从而导致自发性早产。妊娠20周后母体外周血中的cff-DNA水平增加与早产的发生具有显著的相关性，而且cff-DNA浓度的变化先于早产相关临床表现的发生。cff-DNA很可能发展成为一种预测早产发生的可靠指标，但仍需要进一步的分层、定量研究对不同孕周、合并不同妊娠并发症的孕妇及其妊娠结局进行分析。cff-DNA与早产相关的在体研究可能为探索cff-DNA在母体循环中的促炎症作用、对妊娠及早产的影响机制及其潜在的信号通路奠定理论基础。