【套路是这么玩的】reviewer质疑外泌体不纯咋办？老司机带你用实验堵他的嘴！

还是熟悉的字体，还是熟悉的味道，还是那个逗逼兼老司机的hzangs！

原汁原味的hzangs又来逼逼了。既然是逼逼，那就请准许hzangs在这里瞎白活几句，看干货的。直接跳过前三段，谢谢！

第一段！近一年来，外泌体领域发展那叫一个迅猛，国自然中标量是翻倍的涨。但是我们要学习一下当年邓小平爷爷的犀利眼光！然后做出一个结论——目前处于外泌体研究的初级阶段！

犀利！

第二段！目前该领域在生物学和医学中的重要性已经逐渐显现，但外泌体研究还处于并将在一段时间内一直处于初级阶段！这个初级阶段包涵两层含义：1、外泌体领域已经逐渐被人们打开、逐渐被人们认识。2、外泌体的理论体系和研究技术还不完善，还要经过发展并逐渐从初级阶段发展成为一个成熟的研究领域。这是基于目前外泌体领域还没有统一的、简单可行且纯度很高的分离方法、对其他囊泡与外泌体的区别依旧不是十分清楚而作出的判断。

hzangs就随便逼逼几句，别太当真。

第三段！Ps:这段话有没有感觉有点熟悉呢。hzangs其实本想学政治学的，阴差阳错跳了生物的坑，其实吧，政治学也是个坑(ˉ▽￣～) 切~~，hzangs就是一个注定开启人生hard模式的杯具啊。请大家以后根据需要称呼我hzangs或者杯具！

正文来了哈！ 前面铺垫已经结束，由于目前外泌体分离方法还不是很统一，而且分离的效率和纯度都不是很高。蔗糖垫超速离心的纯度不错，但是这个实在繁琐，外泌体之家团队里的个别小朋友已经要被蔗糖垫折磨疯了，所以要求所有的实验都基于蔗糖垫超速离心是不大现实的，但是包括差速超速离心在内的其他方法都不能拿到特别纯的外泌体，那我们又该怎么样避免外泌体样品中的杂质影响我们的结果呢，这就需要利用各种严格对照及rescue（ps：这个词实在不知道怎么翻译，大概就是所谓的“回补实验”吧）来实现了。

记得在hzangs在大一的时候，实验室的一个师兄对我说，“不要把论文想象的太难，它就是新时代的八股文。”到研一之后在新的实验室又一次听到了这句话。当时比较傻，一直不明白。随着在实验室从极品小鲜肉变成回锅老油条（如下图），对这句话也逐渐有了深刻的理解。

变变变！！

所有的生物湿论文，功能实验无外乎3个部分，目标基因的过表达和敲低看功能、寻找下游重复目标基因的功能、rescue目标基因的功能！ 其他的内容主要是机制研究，研究如何调控、通过什么方式调控等等，而机制实验就一个要点——设置严格的对照。完活~

下面呢，hzangs具体给大家分析一下运用哪些实验堵reviewer的嘴。

hzangs在这里用王红阳、王林辉老师发表在cancer cell 的paper举个栗子

。原文：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA.

Reviewer扔来炸弹！No.1

reviewer问：“你怎么知道你的lncRNA是在外泌体里面，而不是你分离外泌体的时候将游离的lncRNA一起分离到了外泌体溶液中？”

这样做！

简单有力！ 用RNase单独处理外泌体样品，发现与对照相比lncRNA在样品中的丰度不变；但如何将破膜剂与RNase同时使用，lncRNA在样品里的丰度明显低于了对照。这足以说明，这个lncRNA是被膜包被的，样品里有完整膜结构的只能是外泌体（Evs等 忽略这个细节）！如果是目标分子是蛋白怎么办呢？一样的，把RNase换成proteinase，把qPCR实验换成WB，拿走不谢！

成功堵嘴！

Reviewer扔来炸弹！No.2

如果reviewer又问了:“你怎么知道是你外泌体中的RNA起作用而不是外泌体样品中作为杂质的游离RNA发挥作用的？”

这样做！

拿不同来源的外泌体处理非耐药细胞，看细胞耐药能力（786-O是母细胞系、7Su3rd是从前者利用药物筛选得到的抗药细胞系，suni是一个化疗药的名称）。本来7Su3rd的外泌体是可以赋予非耐药细胞耐药能力的（图中紫色线），但是利用siRNA敲低7Su3rd中lncRNA后拿到的外泌体不再具有这一能力（图中橘黄色线）。因为前文已经证明lncRNA在囊泡里，这样就完美回答了reviewer的疑问。Ps:曾经论坛里的惜名大神还为我们提供了另一个思路，即使用RNase和proteinase处理掉外泌体样本中的杂RNA和杂蛋白，然后再拿这个外泌体实验，拿到与之前一样的结果，也可以说明起作用的分子在外泌体里面。

又成功堵嘴！

Reviewer扔来炸弹！No.3

如果reviewer再问了：“你怎么知道是你外泌体里的特定RNA传递到了受体细胞，而不是外泌体刺激受体细胞表达了特定的RNA？”

这样的问题有点丧心病狂啊！ But 老司机有办法。一般reviewer也不会这么丧心病狂，所以hzangs也就不再贴文章了。毕竟让人感觉hzangs看paper很多，是一种不谦虚的表现。

假设我们研究的是RNA-a ，这种问题可以通过两种方法证明：1、直接在受体细胞中利用CRISPR-cas9敲除a基因，再利用外泌体刺激受体细胞，之后检测受体细胞中RNA-a的水平，如果在受体细胞中检测到了RNA-a，即可证明RNA-a来源于外泌体，而不是受体细胞自身表达的。2、利用点突变技术构建一个携带特定点突变的RNA-a基因，在外泌体供体细胞中过表达，然后收取外泌体，刺激受体细胞，再在受体细胞中检测发现携带特定点突变的RNA-a，而WT型的RNA-a水平没有明显变化。即可说明问题。

再次成功堵嘴！

好了，今天的和reviewer大战的姿势就交流到这里。其实hzangs的这些举例并不是十分严谨，还是需要一些其他实验来佐证自己的结果，这部分内容我们在以后的日子里在慢慢讨论。

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